基質與微生物之比(F/M)對醬渣厭氧發酵產酸的影響*

齊希光，李秀芬

1(江南大學 食品學院，江蘇無錫，214122)2(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇無錫，214122)

我國是醬油生產及消費大國，僅2010年，就產生了約470萬t的醬渣(含水75%)。醬渣是指釀造醬油原料經制曲、發酵、淋出醬油后產生的固體殘渣。醬渣(干基)中含有約20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纖維、8%～12%水分、0.5%～2%鹽分和豐富的礦物質，再利用價值很高。目前，醬渣主要是用作肥料和飼料，但由于含鹽度高，用量受到限制［1］。而其回收利用和深度加工尚處于研究階段，主要集中在提取油脂、膳食纖維、黃酮和鮮味劑等成分，研究結果尚不理想。

有機廢棄物厭氧發酵會產生多種揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，如乙酸、丁酸等，可作為發酵工業原料生產高附加值的發酵產品(如角質酶)，或作為化工原料合成其他產品(如聚乳酸)。研究表明［2］，厭氧生物處理過程中基質與微生物之比(F/M)對其進程影響很大。一般來說，較高的F/M可獲得較多的產物，但轉化率較低，高濃度底物也可能對產酸具有抑制作用。Ginkel等［3］研究發現，當發酵底物葡萄糖濃度為10～30 g/L時，產生的有機酸質量占總酸化產物的比例高達90%以上，而當葡萄糖濃度上升至40 g/L時，比例降低到38%。而較低的F/M同樣會降低有機酸的產量。

目前，生物質厭氧發酵產酸的研究主要集中在污水處理廠污泥、餐廚垃圾、藍藻等的處理，而有關醬渣厭氧發酵產酸研究報道鮮見。通過優化醬渣厭氧發酵產酸的F/M，將醬渣中的有機成分盡可能多地轉化成乙酸等揮發性脂肪酸，可在實現醬渣減量化的同時，生產高附加值產品。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及操作條件

醬渣(江蘇某釀造廠)溶液濃度為100 g/L，用4 mol/L的HCl和NaOH調節pH至11.0，90℃預處理2 h，離心后的上清液作為發酵產酸的底物。其中，可溶性蛋白質和碳水化合物的濃度分別為3.5～5.0 g/L和3.0～4.0 g/L。接種污泥為無錫市某污水處理廠的消化污泥，其VS/TS為62.90%。將此污泥放入有效容積為2 L的UASB反應器中馴化［4］，所得酸化接種污泥的VS/TS為78.10%。初始發酵pH值為9.0，F/M(即醬渣預處理液與接種污泥質量之比)分別為 1∶0，1∶1，3∶1，5∶1，10∶1，20∶1和 50∶1。充 3 min氮氣后用橡膠塞密封，放入120 r/min的搖床中厭氧發酵 10 d［5－6］，發酵溫度為 35 ℃。

1.2 分析測試項目及方法

1.2.1 VFA的濃度

測定前樣品預處理:取5 mL厭氧產酸發酵液，8 000 r/min離心5 min，用0.45 μm的微濾膜過濾，取濾液0.5 mL于離心管中，加入同體積0.835 g/L的4-甲基戊酸溶液(作為內標)和同體積3 mol/L的磷酸溶液(促使溶液中的VFA在進樣室內氣化)，混勻，再次8 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液裝入氣相色譜進樣瓶，進島津2010氣相色譜儀檢測。氣相色譜測定參數:AOC-20i自動進樣器;FID檢測器;PEG-20M毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm，大連中匯達科學儀器有限公司);采用一階程序升溫，初溫80℃，保持3 min，后以15℃/min的速率升至210℃，保持2 min。進樣室和檢測器的溫度都設為250℃。

1.2.2 蛋白酶的活性

蛋白酶活性的測定根據GB/T23527－2009方法進行，即利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸與福林-酚試劑的顯色反應，來間接測定蛋白酶的活力。具體步驟為:A.將樣品組(包括1 mL酶樣即離心后上清液和1mL 10 mg/mL的酪素溶液)和空白組(1 mL酶樣和2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸)40℃加熱10 min。B.在樣品組加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，向空白組加入1mL 10 mg/mL的酪素溶液，靜置10 min后過濾。C.各取濾液1 mL，分別加5 mL 0.4 mol/L的Na2CO3和1 mL福林-酚試劑，40℃顯色20 min后，680 nm吸光度下比色。1 mL酶樣在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5)條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性需分別測定，酪素溶液也分別用乳酸緩沖液(pH=3.0)、磷酸緩沖液(pH=7.5)和硼酸緩沖液(pH=10.5)配制。

1.2.3 α-淀粉酶的活性

淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測定，麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸還原成3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色物質)，其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時間(1 min)內生成麥芽糖的質量(mg)表示淀粉酶活性的大小。具體步驟為:(1)樣品組和空白組都包括有1 mL的酶液，首先在70℃恒溫水浴中(水浴溫度的變化不應超過±0.5℃)加熱15 min，在此期間β-淀粉酶鈍化。(2)取出后，迅速在水浴中徹底冷卻。(3)樣品組和空白組各加入1 mL pH 5.6檸檬酸緩沖液。(4)向空白組中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以鈍化酶的活性。(5)將樣品組和空白組置于40℃(±0.5℃)恒溫水浴中準確保溫15 min。(6)分別加入40℃下預熱的1% 的淀粉溶液2 mL，搖勻，立即放入40℃水浴中準確保溫5 min。(7)取出后，向樣品組迅速加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以終止酶的活性，然后準備下一步糖的測定。(8)取以上樣品組中酶作用后的溶液及空白組中的溶液各1 mL，分別放入15 mL具塞刻度管中，再加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑混勻，置于沸水浴中煮沸5 min。(9)冷卻，用蒸餾水稀釋至15 mL，混勻，510 nm吸光度下比色。

1.2.4 其他指標及測定方法

蛋白質含量采用考馬斯亮藍G250染色法測定［7］;碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法測定［8］。

2 結果與討論

2.1 F/M對溶解性蛋白質和碳水化合物降解的影響

厭氧發酵10 d后，系統F/M對厭氧發酵前后可溶性蛋白質濃度的影響如圖1所示。系統F/M越低，微生物的相對數量越多，降解轉化蛋白質能力越強，所得降解速度越快，在F/M為1∶1時，可溶性蛋白質降解率最高，達71.23%。在F/M為1∶0時，即未添加酸化接種污泥時，蛋白質也有所降解，這可能是因為環境中本身存在一定微生物，因此也存在一些代謝活動，導致部分蛋白質被降解。不同F/M條件下，發酵前后可溶性碳水化合物濃度變化如圖2所示。可見，F/M對碳水化合物的降解規律類似蛋白質，F/M越低，微生物數量越多，降解轉化碳水化合物的能力越強，同樣，在F/M為1∶1時，碳水化合物降解率最高，達73.43%。在F/M為1∶0時，即未添加酸化接種污泥時，碳水化合物也有所降解，原因同上。

圖1 F/M比對可溶性蛋白質降解的影響Fig.1 Influence of F/M on the degradation of soluble proteins

2.2 F/M對蛋白酶活性的影響

圖2 F/M可溶性碳水化合物降解的影響Fig.2 Influence of F/M on the degradation of soluble carbohydrates

水解通常被認為是厭氧發酵過程中的限速步驟。胞外水解酶能夠加速蛋白質和碳水化合物等有機底物水解產酸，因此，胞外水解酶的活性在VFA產生過程中起著重要作用，水解酶的活性可間接反映厭氧酸化的程度。不同F/M條件下，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性隨發酵時間的變化如圖3、圖4和5所示。可見，隨F/M比降低，蛋白酶活性逐步升高，并在F/M為1∶1時達最大，此時，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性分別為5.336、3.964和4.726 U/mL。較低的F/M意味著接種的酸化污泥量相對較高，產酸微生物的數量相對較大，其生長代謝分泌的水解蛋白酶相應增加，對可溶性蛋白質的分解能力相應增強。這與之前研究得出的結論“蛋白質降解率在F/M為1∶1時達到最大值”相呼應。廢棄醬渣厭氧發酵產酸過程中酸性、中性和堿性蛋白酶活性的變化趨勢，與張無敵等［9］研究雞糞厭氧消化過程中水解蛋白酶活性的研究結果及Jones等［10］研究生活垃圾中蛋白質等有機質發酵過程蛋白酶活性的變化趨勢均一致。

圖3 F/M對發酵過程中酸性蛋白酶活性的影響Fig.3 Influence of F/M on the activity of acid-protease

同時可以發現，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性均隨發酵時間延長而呈現先增加后降低的趨勢，酸性蛋白酶活性在發酵2 d時達到最大值，中性蛋白酶活性在4 d時達到最大值，而堿性蛋白酶活性的最大值出現在6 d左右。

2.3 F/M對α-淀粉酶活性的影響

圖4 F/M對發酵過程中中性蛋白酶活性的影響Fig.4 Influence of F/M on the activity of neutral-protease

圖5 F/M對發酵過程中堿性蛋白酶活性的影響Fig.5 Influence of F/M on the activity of alkaline-protease

α-淀粉酶可用來間接指示碳水化合物的降解程度。F/M對α-淀粉酶活性的影響及其隨時間的變化情況如圖6所示。與蛋白酶活性不同，隨發酵時間不同，α-淀粉酶活性總體較平穩，但仍受系統F/M的影響。當F/M為1∶1時，α-淀粉酶活性都較高，在發酵時間為144 h時，達14.04 μg maltose/min。較低的F/M條件下，系統中接種酸化污泥提供的產酸微生物數量較多，分泌水解碳水化合物的酶如α-淀粉酶相應增加，對淀粉等碳水化合物的分解能力相應增強。這與之前得出的結論“碳水化合物降解率在F/M為1∶1時達到峰值”相符。α-淀粉酶活性的變化趨勢和Zhang等研究高濃度固體有機廢物水解過程胞外水解淀粉酶活性變化趨勢一致［11］。

圖6 F/M對發酵過程中α-淀粉酶活性的影響Fig.6 Influence of F/M on the activity of α-amalyse

2.4 F/M對厭氧酸化產物濃度及分布的影響

厭氧發酵末端產物的分布主要取決于各生態因子綜合作用下占主導地位的微生物種群的獨立代謝途徑，即一旦環境條件適于某一種群，該種群就會迅速占據主導地位，其生理代謝就決定了發酵末端產物的類型［2］。VFA是酸化階段的主要產物，乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸可直接由碳水化合物及蛋白質發酵獲得，更高分子量的揮發性脂肪酸，如正戊酸和異戊酸等主要由蛋白質發酵獲得，因為對不含蛋白質的底物進行酸化研究發現，不生成正戊酸和異戊酸［5］。不同F/M條件下，厭氧酸化產物濃度隨F/M的影響如圖7所示。可見，F/M越高，即底物相對于微生物的含量越高，發酵結束時生成的VFA濃度就越大，發酵產物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸為主，其次為丙酸和正丁酸。當F/M為1∶0，即未添加酸化污泥時，由于降解有機質的微生物很少，在較短的發酵周期內，VFA產量較低。

圖7 F/M對厭氧酸化產物濃度及分布的影響Fig.7 Influence of F/M on the concentration of organic acids and their distribution

Logan等研究發現，乙酸可作為微生物燃料電池的底物產電［12－13］，乙酸還可化學合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工業塑料的單體，也可化學合成醋酸纖維素，再進一步轉化為乳膠涂料、色素等［14］，是重要的化工原料。因此，通常希望厭氧發酵產生的有機酸以乙酸為主。F/M對乙酸占總末端發酵產物之比的影響如圖8所示。與總酸濃度與F/M的相關性不同，在F/M為1∶1時，乙酸占總末端發酵產物比例最高，達82.19%。

圖8 F/M對乙酸占總末端發酵產物比值的影響Fig.8 Influence of F/M on the percentage of acetatic acid

另外，除乙酸外，相對于其他有機酸，不同F/M條件下，厭氧產酸過程中均存在明顯的丙酸累積現象，F/M為20∶1時，丙酸累積量最高，約為4.00 g/L。在厭氧產甲烷過程中，也常出現丙酸累積現象。有機物的厭氧消化，主要是在水解發酵產酸菌群、產氫產乙酸菌群和產甲烷菌群等不同微生物類群的協同作用下逐步完成的。其中，產氫產乙酸菌群將產酸發酵菌群代謝產生的丙酸、丁酸、乙醇等轉化為乙酸、氫氣和二氧化碳。然而，從生化反應的能量學角度分析，丙酸的產氫產乙酸代謝是所有VFA厭氧氧化中最難發生的反應，因在標準狀態下，丙酸被轉化為乙酸反應的吉布斯自由能高達 76 kJ/mol［15］，為正值，不能自發進行，因此，丙酸常在厭氧消化系統中累積［16］。

2.5 F/M對有機酸產量的影響

通常情況下，厭氧發酵結束時，有機酸濃度越高，后提取越容易，提取成本越低。然而，從廢物資源化的角度，同時希望原料中的有機物(蛋白質和碳水化合物等)能被最大限度的轉化為目標產物，不僅可實現廢物的充分減量，同時目標產物的產出率也達到最大。本項研究中，通過調整醬渣預處理液與接種污泥的體積之比調控系統的F/M，并考察其與有機酸產量的關系，因此，所給醬渣預處理液即底物的體積不同。以單位體積底物產酸量折算，所得單位體積末端發酵底物產量及單位體積乙酸產量如圖9和圖10所示。可以看出，與厭氧發酵產物中有機酸濃度隨F/M增加而增大不同，在系統F/M為1∶1時，單位體積末端發酵底物產量及單位體積乙酸產量都是最高的，分別為0.17 g/mL和0.14 g/mL。盡管F/M為50∶1時，最終有機酸及乙酸的濃度最高，但在F/M為1∶1時，有機酸及乙酸的轉化率才最大，乙酸在有機酸中的比例也最高。這與各類蛋白酶及α-淀粉酶的活性有關，此時，各類蛋白酶及α-淀粉酶的活性最大，醬渣預處理液中蛋白質和碳水化合物的降解率最高，因此，有機酸特別是乙酸的產率最高。

圖9 F/M對單位體積預處理液末端發酵產物濃度的影響Fig.9 Influence of F/M on the yield of total organic acids

圖10 F/M對單位體積預處理液乙酸濃度的影響Fig.10 Influence of F/M on the yield of acetic acid

3 結論

(1)當F/M為1∶1時，醬渣預處理液中蛋白質及碳水化合物的降解率最大，分別為71.23%和73.43%。此時，蛋白酶及α-淀粉酶活性也最高，酸性、中性和堿性蛋白酶及 α-淀粉酶的活性分別為5.336 U/mL、3.964 U/mL、4.726 U/mL 及 14.04 μg maltose/min。可溶性蛋白質在發酵初期(2 d內)的轉化主要源于酸性蛋白酶的催化降解，酸性蛋白酶的活性對厭氧發酵產酸過程較為關鍵，之后是中性蛋白酶的催化降解，而在發酵后期(6 d后)，主要依賴堿性蛋白酶的作用。

(2)當F/M為1∶1時，單位體積的醬渣預處理液末端發酵產物的濃度和乙酸濃度均最高，分別為0.17g/mL和0.14g/mL，同時，乙酸占總末端發酵產物比例也最大，為82.19%。發酵產物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等，但均以乙酸為主，其次為丙酸和正丁酸。不同F/M條件下，厭氧產酸過程中均存在明顯的丙酸累積現象，F/M為20∶1時，丙酸累積量最高，約為4.00 g/L。

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