蟲草枸杞復合發酵工藝研究

楊小萍，岳思君，徐春燕，蘇建宇

(寧夏大學生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川，750021)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又稱北冬蟲夏草，屬麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草菌屬(Cordyceps)［1］，其活性成分和藥理作用與冬蟲夏草相似［2－5］，具有補肺益腎、滋補強身、抗癌、抗疲勞、抗衰老、提高免疫力等功效［6］，其中尤以蟲草菌素、蟲草酸和蟲草多糖的藥用價值最為顯著［7］。

研究表明，枸杞能促進蛹蟲草的生長和有效成分的積累，使蛹蟲草的產量得到提高、保健功能得到增強［8］。同時，蟲草對枸杞中的糖類、蛋白質、纖維等物質的利用，以及在代謝過程中對一些重要的有效成分進行轉化，有助于提高枸杞活性成分在復合制劑中的功效［9］。本文在蛹蟲草液體培養不同時期加入以不同方式獲取的枸杞汁，對其復合發酵工藝進行研究，并對發酵產物有效成分含量及清除羥自由基能力進行比較分析，以期開發出一種兼具蟲草和枸杞二者活性物質的發酵制品。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌種

蛹蟲草(Cordyceps militaris 14013)，購買自中國工業微生物菌種保藏管理中心，實驗室保藏。

1.1.2 枸杞

市售寧夏中寧枸杞。

1.2 培養基

種子培養基:NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，Mg-SO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，水1 000 mL，pH 6.0。

發酵培養基:NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，另添加一定量的枸杞汁，并根據加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其終濃度為30 g/L，pH 6.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛹蟲草搖瓶發酵

種子培養:從試管斜面中切取約1 cm2帶培養基的斜面菌絲，接入裝有75 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，25℃、150 r/min 培養 4 d。

蟲草枸杞復合發酵:500 mL搖瓶中裝入150 mL發酵培養基，接種量10%，25℃、150 r/min振蕩培養。

1.3.2 枸杞汁的制備

枸杞水提液制備:稱取枸杞10 g，洗凈，加6倍水浸泡1 h后，煮沸30 min，倒出枸杞汁，再在枸杞渣中補加適量的水，煮沸20 min，合并枸杞汁，過濾，定容至1 000 mL。以3，5-二硝基水楊酸法測定枸杞汁中的糖含量。

枸杞勻漿液制備:稱取枸杞10 g，洗凈，加6倍水浸泡1h后，榨汁機粉碎，紗布過濾得勻漿液，再在枸杞渣中補加適量的水，重復打磨2次。合并枸杞汁，過濾，定容至1 000 mL，制備成濃度為10 g/L的枸杞勻漿液。按上述方法分別制備20、30和40 g/L的枸杞勻漿液。以3，5-二硝基水楊酸法測定枸杞汁中的糖含量。

1.3.3 發酵產物干重的測定

取一定量的搖瓶發酵液，4 000 r/min離心20 min，棄上清液，水洗，重復數次，至上清液為無色。收集沉淀，于80℃烘至恒重，在干燥器中冷卻至常溫，稱重并研磨成細粉，重復5次。

1.3.4 蟲草素的提取與測定

微波提取法［10］:精確稱取0.1 g發酵產物，加入20 mL蒸餾水中，微波處理60 s，功率200 W，過濾，濾液定容至250 mL，各組重復3次。用紫外分光光度法［11］測定蟲草素含量。

1.3.5 蟲草酸的提取與測定

精確稱取0.2 g發酵產物，加入20 mL 70%的乙醇中，微波處理80 s，功率200 W。過濾，蒸餾水洗滌殘渣，將濾液、洗液合并于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，從中吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，作為待測樣品，各組重復3次。用紫外分光光度法測定蟲草素含量。

1.3.6 多糖的提取與測定

熱水浸提法［12］:稱取發酵產物0.5 g，加入15 mL蒸餾水中，70℃水浴浸提2.5 h。提取液10 000 r/min離心10 min，上清液定容至15 mL，吸取1 mL，稀釋至250 mL，為待測樣品，各組重復3次。用苯酚硫酸法［16］測定胞內多糖含量。

1.3.7 發酵產物清除羥自由基能力測定

采用羥自由基測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，按照說明書中方法測定。

2 結果與分析

2.1 枸杞汁制備方式的選擇

為了確定復合發酵過程中枸杞汁適宜的制備方式，分別取75 mL 10 g/L的枸杞水提液和枸杞勻漿液加入75 mL發酵培養基中，使培養基中枸杞汁濃度分別為5g/L。以不添加枸杞汁為對照，發酵168 h，每24 h取樣測定發酵產物干重，結果如圖1所示。

圖1 蟲草生長曲線Fig.1 The growth curve of Cordyceps militaris

由圖1可知，不添加枸杞汁時，蛹蟲草培養48 h后進入快速生長期，96 h時發酵產物干重達到最大為5.50 g/L，并在96～144 h基本保持不變，144 h后發酵產物干重開始下降，生長進入衰亡期。生長期菌體平均生長速率為0.16 g/h。

培養基中添加枸杞水提液，蛹蟲草培養24 h后進入快速生長，96 h時發酵產物干重達7.00 g/L，120 h時獲得最大發酵產物干重為7.60 g/L，144 h后進入衰退期。生長期菌體平均生長速率為0.20 g/h。

培養基中添加枸杞勻漿液，蛹蟲草培養24 h后進入快速生長期，96 h時發酵產物干重達7.60 g/L，144 h時獲得最大發酵產物干重為8.20 g/L，168 h后進入衰退期。生長期菌體平均生長速率為0.24 g/h。

結果表明，培養基中添加枸杞汁可以提高菌體生長速率，增加發酵產物干重。其中添加枸杞水提液發酵產物干重較對照增加38.18%，添加枸杞勻漿液菌體最高發酵產物干重較對照增加49.09%。由于枸杞勻漿液較多地保留了枸杞的成分，對蛹蟲草生長的促進作用更為明顯，且制備簡便，便于工業化生產，因此，蟲草-枸杞復合發酵過程中枸杞汁的制備方式以勻漿法更為適宜。

2.2 枸杞汁添加量的確定

按1.2所述，分別添加濃度為10、20、30和40 g/L的枸杞勻漿液配制發酵培養基，使發酵培養基中枸杞汁濃度分別為5、10、15和20 g/L，以不添加為對照，搖瓶發酵144 h，測定發酵產物干重和蟲草有效成分含量，結果如圖2和圖3所示。

圖2 添加不同濃度枸杞汁的發酵產物干重Fig.2 Fermentation product dry weight with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

培養基中枸杞勻漿液濃度為10 g/L時發酵產物干重最大為7.60 g/L，較對照提高了37.43%，濃度為5 g/L時次之，為6.23 g/L，較對照提高了12.66%。

培養基中添加10 g/L枸杞勻漿液時，發酵產物蟲草素含量顯著增加，為13.18 mg/g，較對照增加了52.48%，其他添加5 g/L和20 g/L的枸杞勻漿液則無顯著變化。

培養基中枸杞勻漿液濃度為5 g/L時發酵產物多糖含量顯著增加，為19.29 mg/g，較對照提高了23.81%，10 g/L枸杞勻漿液則無顯著變化。

圖3 添加不同濃度枸杞汁的蟲草有效成分含量Fig.3 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

與對照組相比，隨著枸杞勻漿液濃度的增加，蟲草酸含量逐漸降低，枸杞勻漿液濃度為5 g/L時蟲草酸含量與對照組相當。

綜合考慮發酵產物干重和產物有效成分含量，枸杞勻漿液的最適添加濃度應為5 g/L。

2.3 枸杞汁添加時期的確定

由蟲草生長曲線(圖1)可知，培養基中添加枸杞勻漿液后，蛹蟲草培養至24～96 h時進入快速生長期，96 h后蟲草生長進入穩定期。為保證枸杞汁的充分利用與轉化，選擇在蟲草進入快速生長期之前和之中(即蟲草發酵第0、24、48和72 h)加入枸杞勻漿液。發酵培養基中枸杞汁濃度為5 g/L，根據加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其終濃度為30 g/L。發酵144 h，測定發酵產物干重和蟲草有效成分含量，結果如圖4和圖5所示。

圖4 枸杞液不同加入時期的發酵產物干重Fig.4 Fermentation product dry weight with adding Lycium barbarum juice in different period

由圖4可知，枸杞勻漿液的添加時期對發酵產物干重有顯著影響(P＜0.05)，發酵48 h加入枸杞勻漿液時，發酵產物產量最大為13.04 g/L，較蟲草菌絲體提高了135.80%，發酵72 h時加入次之，發酵產物產量為11.73 g/L，較蟲草菌絲體提高了112.12%。

圖5 枸杞液不同加入時期的蟲草有效成分含量Fig.5 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding Lycium barbarum juice in different period

由圖5可知，枸杞勻漿液的添加時期對產物蟲草素含量無顯著影響(P＞0.05)，但對產物蟲草酸和多糖含量影響顯著(P＜0.05)，在發酵第72 h時加入枸杞勻漿液，產物蟲草酸和多糖含量均為最大，分別為178.21和30.73 mg/g。

綜合考慮發酵產物產量和有效成分含量，在發酵第72 h時加入枸杞勻漿液最為有利，在此工藝條件下發酵144 h，復合發酵產物產量可達11.73 g/L，較蟲草菌絲體升高了112.12%。其中蟲草素含量達11.23 mg/g，蟲草酸含量178.21 mg/g，多糖含量達30.73 mg/g，分別較蟲草菌絲體升高了29.98%、64.46%和97.20%。

2.4 蟲草枸杞復合發酵產物清除羥自由基能力

按照以上復合發酵工藝發酵144 h，對復合發酵產物清除OH·能力進行測定，結果如圖6所示。從圖6中OH·清除能力可以看出，復合發酵產物清除OH·能力為39 643 U/g，介于枸杞和單純蟲草粉之間，比未添加枸杞勻漿液的蟲草粉提高了44.62%。枸杞富含枸杞多糖，其清除OH·能力最高，為50 126 U/g。對比圖6中每升發酵液所含或者所獲取樣品的OH·清除能力可以發現，由于配制發酵培養基時每升發酵培養基中添加的枸杞為5.00 g，而蟲草發酵和復合發酵所獲得的產物產量分別為5.53 g/L和11.73 g/L，使得從每升發酵液中獲得的復合發酵產物具有最高的OH·清除能力。進一步比較發現，復合發酵產物的OH·清除能力(46 501 U/L)顯著高于蟲草粉和枸杞的加和(39 588 U/L)，由此說明復合發酵過程中可能發生了有效物質的生物轉化。綜上，培養基中添加枸杞勻漿液在提高發酵產物干重和有效成分含量的同時，顯著提高了發酵產物清除OH·能力，提示復合發酵產物具有更好的抗氧化性。

圖6 三種樣品清除羥自由基能力比較Fig.6 Comparison of hydroxyl radical scavenging activities of the three samples

3 結論

通過對蛹蟲草液體發酵過程中添加枸杞汁的研究，確定了蟲草枸杞復合發酵工藝條件為:以勻漿法制備枸杞汁，培養基中枸杞汁濃度5 g/L，發酵72 h時添加，發酵周期144 h，復合發酵產物產量達11.73 g/L，較蟲草菌絲體升高了112.12%。其中蟲草素含量為11.23 mg/g，蟲草酸含量為178.21 mg/g，多糖含量為 30.73 mg/g，較蟲草菌絲體分別提高了29.98%，64.46%和97.20%，同時，復合發酵產物清除OH·能力較蟲草菌絲體提高了44.62%。

蟲草枸杞復合發酵工藝的確定對開發兼具蟲草和枸杞二者活性物質的新型功能發酵制品具有重要的參考意義。

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