富硒發芽對大豆蛋白凝膠性質的影響*

王素雅，胡丹丹，楊曉亞，鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制與深加工技術重點實驗室，江蘇南京，210023)

大豆中含蛋白質40%左右，是我國人民重要的蛋白質來源。但大豆含有胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和植酸等抗營養因子，會影響人體對其營養成分的吸收利用。大豆發芽不僅能減少胰蛋白酶抑制因子、植酸以及植物凝集素等不利于人體消化吸收的因子，而且水溶性維生素、大豆異黃酮和γ-氨基丁酸等有益成分含量增加，并形成新型風味和口感，是營養豐富的健康食品［1］。

硒是人體必需的微量元素，但我國2/3的地區缺硒［2］，補充富硒食物是解決硒缺乏的重要途徑。通過種子發芽法將無機硒轉化為有機硒，具有工藝簡單、操作簡便、生產穩定、周期短、產品易于標準化、成本低等優點，因此，富硒發芽產品備受研究者關注［3－4］。大豆在食品中的應用不僅與其營養價值相關，也與其蛋白質的功能性質也密不可分。由于許多大豆加工品利用其凝膠性質，因此，凝膠性質是大豆蛋白最重要的功能性質之一。然而，發芽對大豆凝膠性質有一定的影響［5］，因此，探討富硒發芽過程對大豆蛋白凝膠性質的影響，可為開發不同形式的富硒大豆產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與藥品

大豆:東北大豆，購自南京原糧市場。

葡萄糖酸-δ-內酯(GDL):江蘇常州康力食品添加劑廠。

Na2SeO3，NaOH，HCl，正己烷，乙醇，NaClO，NaBH4，甘油，異丙醇，苯酚，甘氨酸，丙烯酰胺，N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，四甲基乙二胺(TEMED)，考馬斯亮藍R250，十二烷基硫酸鈉(SDS)，過硫酸銨，β-巰基乙醇，溴酚藍，以上所用試劑均為分析純(AR)或生化試劑。

硒標準溶液(1 000μg/mL):Sigma公司;標準蛋白(14.4～97.4kDa):Solarbio公司。

1.2 實驗儀器設備

HG75－3型電熱恒溫兩用箱，南京實驗儀器廠;PHS－25型pH計，上海精密科學儀器有限公司;HH－6型恒溫水浴鍋，常州市國華電器有限公司;TDL－80－2B型離心分離機，上海安亭科學儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;AIPHAI-4LDpluo真空冷凍干燥機，德國Marin Chris;Bio-Rad165－8003型電泳儀/電泳槽，美國Bio-Rad公司;TA.XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro Systems Ltd;AFS-3100雙道原子熒光分光光度計，北京科創海光儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒大豆籽粒發芽

挑選成熟飽滿，無蟲蛀，無霉變，無破損的大豆種子，20 g，用質量分數1.0%的NaClO溶液浸泡5 min消毒，蒸餾水沖洗后，分別加50 mL 10 mg/L Na2SeO3溶液(富硒)和蒸餾水(對照)，于恒溫(25℃)培養箱中浸泡6 h，將浸泡后的大豆粒置于25℃恒溫培養箱中發芽，每隔12 h取樣，96 h后停止發芽。豆芽用蒸餾水沖洗3遍，置于60℃烘箱中烘干，備用。

1.3.2 硒含量測定

采用氫化物發生原子熒光法測定硒含量(GB5009.93－2010)。

總硒(total selenium，T-Se)含量的測定:稱取0.5 g 大豆粉于消化管中，加 10 mL HNO3、2 mL H2O2，振搖混合均勻，于微波消化儀中消化。消化完全后轉入三角瓶中，加幾粒玻璃珠，在電板上繼續加熱至近干，切不可蒸干，再加5.0 mL 6mol/L HCl，繼續加熱至溶液變為清亮無色并伴有白煙出現，將6價硒還原成4價硒。冷卻，轉移消化液于25 mL容量瓶中定容，用于總硒含量的測定。

大分子有機硒(organic selenium，O-Se)的測定采用持續透析法［4］。將大豆粉裝入透析袋(截留分子質量3 500kDa)，25℃去離子水透析5 d，每隔12 h換1次水，測定透析后袋里樣品硒含量即為有機大分子有機硒的含量。

1.3.3 GDL大豆凝膠的制備

將發芽大豆加水(料液比1∶6，g∶mL)磨漿，紗布過濾，豆漿在不斷攪拌下小火煮沸3～5 min，脫氣。向豆漿中加入2.8 g/L GDL并混勻，85℃保溫20 min后，放入冰水中冷卻成型，4℃冰箱保存備用。

1.3.4 大豆分離蛋白的制備［6］

發芽大豆→60℃烘干→磨粉→正己烷脫脂→烘干→堿提酸沉法提取→冷凍干燥→SPI

1.3.5 GDL大豆分離蛋白凝膠制備［5］

120 g/L的SPI溶液→90℃水浴加熱15 min→加2.8 g/L GDL→80℃保溫30 min→冷卻→4℃保存備用。

1.3.6 大豆蛋白質分子質量的測定

SDS-PAGE法［7］:采用15%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳時的電壓200 V，電流100 mA，功率50 W。3～4 h后，待溴酚藍剛剛遷移出凝膠底部時終止電泳，考馬斯亮藍染色2 h，將凝膠置于脫色液中漂洗，每隔2 h換1次脫色液，直至背景清晰為止。

1.3.7 凝膠硬度的測定［5］

用TA-XT2i質構儀測定大豆凝膠與大豆分離蛋白凝膠硬度，主要參數如下:運行模式texture profile analysis(TPA);測前速度2.0 mm/s;測試速度1.0 mm/s;測后速度3.0 mm/s;穿刺距離10 mm;時間2 s;數據采集速率200 pps;圓柱型探頭(P/0.5)。凝膠破碎時受到的最大力作為凝膠硬度指標，力越大凝膠硬度越大。

1.3.8 凝膠持水性測定［8］

按1.3.3和1.3.5的方法于10 mL的離心管內制備大豆凝膠和大豆分離蛋白凝膠，稱重后(記為m1)于4℃下4 000r/min離心10 min，記錄離心過程中水分損失量(m2)，計算凝膠持水性(WHC)。

2 結果與討論

2.1 富硒發芽過程中大豆總硒與有機硒含量的變化

經Na2SeO3溶液浸泡后，大豆在發芽過程中總硒含量與有機硒含量均有所增加。由圖1可知，10 mg/L Na2SeO3溶液浸泡6 h后，大豆中總硒含量為1.25 μg/g。發芽 12 h 后，總硒含量增至 3.48 μg/g，至發芽48 h時總硒含量趨于穩定，發芽96 h時總硒含量為4.60 μg/g，是未發芽大豆的3.68倍。分析認為Na2SeO3在大豆發芽過程中隨水分子不斷向大豆內部滲透，促使發芽大豆總硒含量升高。大豆中大分子有機硒含量和有機硒轉化率在發芽過程中也呈不斷上升趨勢，發芽12 h時有機硒含量為0.51 μg/g，有機硒轉化率14.57%;發芽至96 h時，有機硒含量增至 2.05 μg/g，轉化率達 44.50%。Sathe［9］等人利用同位素示蹤技術發現，富硒大豆中89%的硒與蛋白質結合，其中大豆分離蛋白占60%。因此，發芽時大豆有機硒含量及有機硒轉化率增加是Se與蛋白質結合并以硒蛋白形式存在的結果。

2.2 富硒發芽過程中大豆蛋白分子質量的變化

大豆蛋白根據沉降系數的不同分為2S，7S，11S和15S球蛋白。其中主要由7S和11S球蛋白組成，分別占大豆分離蛋白的30%和40%［10］。7S球蛋白主要成分是 β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)［11］，由α’(MW～72 kDa)，α(MW～68 kDa)和 β(MW～52 kDa)3個亞基組成，各亞基之間幾乎無二硫鍵［12］。11S球蛋白的主要成分是大豆球蛋白(glycinin)，由6個亞基對經非共價鍵連接而成，每一對亞基由1個酸性亞基(MW～32 kDa)和1個堿性亞基(MW～20 kDa)通過1個二硫鍵相連［13］。11S大豆球蛋白有5種亞基。各亞基的分子質量約為:A3～37 kDa，A1，A2，A4～34 kDa，B3～23 kDa，B1，B2，B4～22 kDa［14］。

實驗分析了不同發芽時間富硒大豆SPI的SDSPAGE電泳圖譜，結果見圖2。圖譜從上到下的區帶分別是7S球蛋白(α’，α，β)區帶和11S球蛋白(A3，A1A2A4，B3，B1B2B4)區帶［12］。由圖2可知，發芽過程中大豆7S球蛋白的β亞基與11S球蛋白的堿性亞基B含量沒有明顯變化，而7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性A3、A隨著發芽而逐漸減少。發芽48 h內，這4種亞基快速減少，說明它們是大豆內源蛋白酶的主要作用對象，被降解為相對分子質量較小的組分。在相同發芽條件下，富硒大豆與對照大豆的蛋白譜帶基本一致，說明富硒處理并未影響蛋白質的代謝途徑，該結果與吳永堯［15］在富硒水稻和趙鐳［16］在富硒靈芝的研究結果一致，硒進入蛋白質代謝但并不改變蛋白質原來的合成代謝途徑。

圖2 發芽大豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE profile of SPI during soybean germination

2.3 富硒發芽過程中大豆凝膠硬度的變化

蛋白質凝膠形成的機理非常復雜，參與形成凝膠網絡結構的作用力包括疏水作用、二硫鍵、氫鍵和靜電相互作用［17］。蛋白質分子受熱變性后，原包埋于卷曲結構內部的疏水基團暴露出來，同時，高溫使蛋白質分子熱運動加劇，分子間相互碰撞的機率增大，因而有助于分子間通過疏水相互作用形成交聯。而且蛋白質變性后暴露出極性的—CO和—NH，使多肽鏈附近形成水化層，有利于形成氫鍵。此外，加熱還會引起—SH和—S—S—的交換反應，形成分子間或分子內的二硫鍵合，這些相互作用和二硫鍵合導致蛋白質凝膠的形成［18］。

以葡萄糖酸內酯(GDL)為凝固劑，富硒發芽大豆GDL凝膠硬度隨發芽時間的變化見圖3。由圖3可知，在發芽過程中大豆GDL凝膠硬度逐漸降低，特別是在發芽48 h內，大豆GDL凝膠硬度由25.25g快速降低至10.77g，降低了57.35%。蛋白質是形成大豆凝膠的主體，因此分析了富硒發芽大豆分離蛋白(SPI)的凝膠硬度隨發芽時間的變化。由圖4可知，在發芽12 h至60 h，發芽大豆SPI的凝膠強度快速下降。發芽48 h時富硒大豆分離分離蛋白GDL凝膠硬度由27.73g降至13.37g，降低了51.79%，與發芽大豆GDL凝膠硬度的變化趨勢一致。根據發芽大豆蛋白質電泳圖譜可知，此時7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3、A降解速度較快，導致蛋白質聚合度降低，凝膠網絡結構變疏松，從而造成大豆蛋白凝膠硬度降低，說明這些蛋白亞基對大豆蛋白凝膠形成具有重要的作用［19］。由圖3，圖4還可看出，發芽過程中富硒大豆的凝膠硬度均略高于對照。硒酸鹽被植物吸收后，按照硫的代謝途徑被進一步同化［20］，因此硒在植物體內主要是以硒代半胱氨酸(Se-Cys)的形式存在［4］。大豆蛋白質分子在受熱變性后，Cys殘基之間形成分子內或分子間的S-S是大豆凝膠形成的原因之一，富硒大豆蛋白中的Se-Cys形成分子內或分子間的Se-Se鍵，根據Shchedrina［20］，用來還原 S-S 的二硫蘇糖醇(DTT)無法還原Se-Se，只有非常強的還原劑才能還原Se-Se，因此Se-Se的解離能要高于S-S，解離能高，化學鍵強度大，分子本身結構穩定，這可能是富硒發芽大豆的凝膠硬度略高于對照的原因。

圖3 發芽過程中大豆凝膠硬度的變化Fig.3 Changes of soybean gel hardness during germination

圖4 發芽過程中SPI凝膠硬度的變化Fig.4 Changes of SPI gel hardness during soybean germination

2.4 富硒發芽過程中大豆凝膠持水性的變化

持水性體現了豆腐凝膠網絡結構的致密性，是豆腐重要特性之一。富硒發芽大豆及其分離蛋白GDL凝膠的持水性見圖5和圖6。由圖5可知，未發芽的富硒大豆GDL凝膠持水性為61.42%，而隨著發芽時間的延長，發芽大豆凝膠的持水性幾乎呈線性降低，至發芽96 h時，富硒發芽大豆凝膠的持水性降至40.34%，降低了34.32%。由圖6可知，未發芽富硒大豆SPI凝膠的持水性為62.64%，在發芽60 h內SPI凝膠的持水性持續降低，發芽60 h時凝膠持水性為50.95%，該結果與大豆凝膠持水性的變化趨勢一致。根據電泳圖譜可知，大豆7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3和A亞基因發芽而逐漸降解，對蛋白凝膠網狀結構造成破壞，在豆腐凝膠結構中產生較大空洞，因此持水性下降［19］。從圖5，圖6還可看出，發芽過程中富硒發芽大豆的凝膠持水性均略高于對照，原因與富硒大豆凝膠的網絡強度高于對照，能更好地將水分鎖在凝膠網絡結構內有關。

圖5 發芽過程中大豆凝膠持水性的變化Fig.5 Changes of WHC of soybean gel during germination

圖6 發芽過程中大豆分離蛋白凝膠持水性的變化Fig.6 Changes of WHC of SPI gel during soybean germination

3 結論

經Na2SeO3溶液浸泡6 h后，在發芽的96 h內，總硒含量、有機硒的含量及有機硒轉化率均隨發芽時間的延長而增加。發芽96 h時大豆總硒含量為4.60 μg/g，有機硒含量增至2.05μg/g，轉化率達44.50%，說明大豆發芽過程具有較強的硒生物轉化能力。富硒大豆和SPI的GLD凝膠硬度與持水性均隨發芽時間的延長而降低。在發芽48 h內，大豆GLD凝膠硬度從25.25g迅速降至10.77g，持水性由61.42%降至51.55%，SPI凝膠硬度從27.73g降至13.37g，持水性由62.64%降至55.54%。富硒大豆SPI的凝膠硬度及持水性均較對照略高，但兩者沒有明顯差異，說明富硒對發芽大豆凝膠性質影響有限。根據發芽過程中大豆凝膠性質的變化規律，可將發芽48 h內的富硒大豆用于開發富硒豆腐類產品，將發芽48 h以后的大豆用于開發豆腦、豆漿等產品。

SDS-PAGE圖譜顯示，富硒大豆的蛋白譜帶與對照組基本一致，說明富硒沒有顯著改變蛋白質的代謝。在發芽過程中，大豆7S球蛋白的α'亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3亞基和A亞基隨發芽時間的延長而被逐漸降解為相對分子質量較小的組成，從而影響發芽大豆凝膠性質，而富硒對大豆蛋白質凝膠性質的影響較小。

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