巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲體抗氧化活性和多糖含量的比較

翟飛紅，王琳琳，韓建榮

1(山西大學 生命科學學院，山西太原，030006)

2(北京中醫藥大學 東方學院渤海校區，河北滄州，061108)

巴西蘑菇(Agaricus blazei)，其商品名又為“姬松茸”。其子實體富含多種有效成分，尤其是其子實體多糖，具有抗病毒、抗腫瘤等作用［1－2］。雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)為蘑菇屬的著名食用菌，因其擔子上通常著生2個擔孢子而得名。雙孢蘑菇肉質肥厚，味道鮮美且熱能低，具有很好的醫療保健作用［3］。

巴西蘑菇與雙孢蘑菇同屬于蘑菇屬，兩者在栽培方法和技術上基本相似。除了其子實體可以利用外，還可以對其菌絲體的發酵產物加以利用。目前，已有文獻表明兩者的子實體均有抗氧化活性［4－6］，對于菌絲體的研究主要集中在液態發酵條件的摸索及氧脅迫條件下菌絲體的生長狀況［7－8］，而對其液態發酵菌絲體多糖含量和抗氧化活性的研究較少。本文研究了巴西蘑菇和雙孢蘑菇經液態發酵獲得的菌絲體的多糖含量和抗氧化活性，為開發利用兩種菌的菌絲體提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌種

巴西蘑菇(Agaricus blazei)和雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)由本實驗室提供，保存于馬糞瓊脂培養基中。

1.2 液態培養基［9］

采用玉米黃豆培養基，配方為:玉米粉20.0 g，黃豆粉10.0 g，酵母粉 2.0 g，蔗糖 20.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO31.0g，(NH4)2SO41.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 試劑

DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)，由 Sigma公司生產;Ferrozine(菲洛嗪)，由美國 BBI公司生產;BHT(2，6－叔丁基－4－甲基酚)，由英國的 Avocado Research Chemicals 公 司 生 產;K3Fe(CN)6、NaH2PO4、Na2HPO4、FeCl3、FeCl2、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、EDTA－Na2、核黃素、苯酚、酒石酸鉀鈉、Na2SO3和3，5－二硝基水楊酸(DNS)，均為國產分析純。

1.4 菌絲球的收集與處理

將貯藏的巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌種切塊接種于PDA培養基上進行活化，將活化后的斜面菌種分別切成1 cm×1 cm的小塊，接種于裝有50 mL液態培養基的250 mL三角瓶中，每瓶接種5塊。接種后在室溫下放置48 h，然后于25℃、150 r/min搖瓶培養7 d。發酵完畢后，過濾收集菌絲球，并用蒸餾水清洗收集到的菌絲球2次。然后將菌絲球置于培養皿中，60℃烘干至恒重，置于密封瓶中備用。

1.5 抗氧化性物質的提取

準確稱取10 g干燥后的菌絲體，置于研缽中研磨，然后分別加入100 mL的80%乙醇溶液，于25℃、130 r/min的搖床上提取24 h，抽濾，取濾液，濾渣在相同的條件下復提，合并2次濾液。濾渣烘干后稱重，計算提取率與初始濃度;濾液在40℃下旋轉蒸發，得到濃縮液，然后用體積分數80%的乙醇溶液定容，待測。

1.6 抗氧化性的測定

1.6.1 DPPH·清除能力［10］

DPPH·是一種穩定的自由基，其乙醇溶液為紫色，在517 nm處有最大吸收峰。當往DPPH溶液中加入自由基清除劑時，溶液顏色會變淺，OD值變小。OD值變小的幅度與DPPH·被清除的程度呈線形關系，故可用于檢測自由基被清除的程度。

根據文獻［10］略做修改。在2 mL不同濃度的樣液中加入2 mL DPPH溶液(0.08 mol/L)，搖勻，靜置30 min，對照用80%的乙醇溶液代替樣品，空白管為樣品加70%的乙醇(DPPH的溶劑)。517 nm處測OD值。DPPH·清除能力(W)計算:

式中:A0為對照吸光度值;A1為樣品吸光度值;A2為空白吸光度值。

樣品的EC50值根據其517 nm下的樣品曲線計算，BHT用作標準。

1.6.2 還原力［11］

當溶液中存在還原劑時，Fe3+和鐵氰化物復合物會接受還原劑給出的電子轉化為Fe2+形式的化合物，進而兩者反應生成普魯士藍(Fe4［Fe(CN)6］3)，其在700 nm處有最強吸收峰，溶液顏色會由黃色變成不同程度的綠色－藍色，故測定700 nm處的OD值即可測定Fe2+濃度。OD值越大，還原力越強。

根據文獻［11］測定。在1 mL不同濃度的樣液中分別依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)和 2.5 mL鐵氰化鉀溶液(1%)，50 ℃保溫 20 min，然后迅速冷卻，加入 2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，離心，取上清液。1.25 mL上清液中依次加入1.25 mL 蒸餾水和0.25 mL 氯化鐵溶液(0.1%)，混合均勻，靜置10 min，700 nm處測OD值。

樣品的EC50值根據其700 nm下的樣品曲線計算，BHT用作標準。

1.6.3 Fe2+螯合能力［12］

根據文獻［12］所報道的方法進行了部分修改。在1.6 mL不同濃度的樣液中分別依次加入1.6 mL蒸餾水、0.4 mL FeCl2(0.5 mmol)、0.4 mL 菲洛嗪(0.5 mmol/L)，然后劇烈搖動1 min，室溫放置20 min后，562 nm處測OD值。空白管(A0)用蒸餾水代替樣液。Fe2+螯合能力(M)計算:

式中:A1為樣品吸光度值;A0為空白吸光度值。

樣品的EC50值根據其562 nm下的樣品曲線計算，EDTA用作標準。

1.6.4 O2－·的清除能力［13］

核黃素－蛋氨酸溶液被光照激發后，核黃素會與O2反應生成O－2·。此時，生成的自由基會將NBT還原為甲月朁(CN4H4)，呈藍色，在560 nm處有特征吸收峰。當往溶液中加入超氧陰離子自由基清除劑時，其OD值會降低。因此比較加入提取液前后的OD值的變化，可以判斷提取液對超氧陰離子自由基的清除能力。

根據文獻［13］方法略做修改。1 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)中分別依次加入 0.3 mL 甲硫氨酸溶液(130 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑藍(NBT，750 μmmol/L)、0.3 mL EDTA－Na2(100 μmol/L)、0.3 mL 核黃素溶液(20 μmol/L)，混勻后加入 2 mL不同濃度的樣液。在3 000 lX光照下放置20 min后，320 nm處測OD值。O－2·清除能力(C)計算:

其中:“A樣品”是指不同濃度樣品的吸光度，“A對照”是指對照的吸光度樣品的EC50根據抗氧化劑活性比例和樣品濃度圖來計算。

1.7 菌絲球多糖的提取

準確稱取3 g干燥后的菌絲體，置于研缽中研磨，轉移至錐形瓶中，加入60 mL NaOH(1 mol/L)，80 ℃ 水浴4.5 h，5 000 r/min 離心 10 min，取上清液，以相同的方法對殘渣進行復提。合并2次濾液，70℃旋轉濃縮，得濃縮液。向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置6 h，5 000 r/min離心10 min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水定容至50 mL，備用。

1.8 多糖含量的測定

1.8.1 總糖含量的測定

采用苯酚－硫酸法［14］。將定容至50 mL的樣品液稀釋50倍，吸取1 mL，然后加入1 mL蒸餾水，1 mL苯酚(6.0%)及5 mL 濃 H2SO4，靜置 10 min，搖勻，室溫下放置20 min，490 nm處測OD值。空白對照用蒸餾水代替樣品液。

1.8.2 還原糖含量的測定

采用 3，5－二硝基水楊酸法［15］。吸取定容至 50 mL的樣品液各2 mL，加入1 mL蒸餾水，3 mL DNS，加熱并煮沸7 min，迅速用流水冷卻至室溫，550 nm處測OD值。空白對照用蒸餾水代替樣品液。

1.8.3 多糖含量的計算

多糖含量/%=總糖含量/%－還原糖含量/%

1.9 統計學分析

實驗設3次重復，實驗結果用SPSS軟件(版本18.0)Duncan多重比較法［16］進行多個均數間的兩兩比較和T檢驗。

2 結果與分析

2.1 DPPH·清除能力的比較

從圖1可以看出，當巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時，二者的DPPH·清除能力也逐漸增強。當濃度為3 mg/mL和6 mg/mL時雙孢蘑菇菌絲球提取液的DPPH·清除能力要高于巴西蘑菇，且差異顯著;當提取液濃度為9、12、15 mg/mL時，雙孢蘑菇菌絲球提取液的清除能力仍高于巴西蘑菇，但差異不顯著，而且隨著濃度的升高，兩者差異逐漸變小;當提取液濃度為15 mg/mL時，雙孢蘑菇對DPPH·的清除率為88.4%，巴西蘑菇為86.97%。

圖1 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的DPPH·清除能力Fig.1 Scavenging effect on DPPH radical of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.2 還原力的比較

由圖2可以看出，當菌絲球提取液的濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時，二者的還原力均逐漸增強，且巴西蘑菇的還原力高于雙孢蘑菇。當濃度較低時，兩種菌的還原力差異不顯著，當濃度增加到15 mg/mL時，兩種菌的還原力有顯著性差異。

2.3 Fe2+螯合能力的比較

從圖3可以看出，當菌絲球提取液濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力均逐漸增強，巴西蘑菇菌絲球提取液在各個濃度下的Fe2+螯合能力分別是雙孢蘑菇的 5.18、2.01、1.79、1.35、1.28 倍。當濃度為 15 mg/mL時，巴西蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力可達到86.38%，而雙孢蘑菇僅為66.56%。由此可得，巴西蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力高于雙孢蘑菇，且差異極顯著。

圖2 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的還原力Fig.2 Reducing power of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

圖3 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力Fig.3 Ferrous Ions’chelating capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.4 O－2·清除能力的比較

從圖4可知，當菌絲球提取液濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時，巴西蘑菇與雙孢蘑菇的O－2·清除能力均逐漸增強;當濃度較低時，巴西蘑菇菌絲球提取液的O－2·清除能力要顯著高于雙孢蘑菇，當濃度增大至15 mg/mL時，兩種菌差異不顯著。由此可得，兩種菌對超氧陰離子均有一定的清除能力，而且巴西蘑菇菌絲球提取液的O－2·清除能力要高于雙孢蘑菇。

2.5 抗氧化性各指標EC50值的比較

由表1可以看出，對于還原力，巴西蘑菇的EC50值遠低于雙孢蘑菇的(僅為其36.8%);對于Fe2+螯合能力，巴西蘑菇的EC50值也明顯低于雙孢蘑菇，其EC50值為雙孢蘑菇的46.5%;對于O－2·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值略低于雙孢蘑菇，其EC50值為雙孢蘑菇的86.0%;而對于DPPH·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值則高于雙孢蘑菇(其EC50值為雙孢蘑菇的1.6倍)。經T檢驗，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液各抗氧化活性指標的EC50值差異顯著。綜上所述，巴西蘑菇菌絲球提取液的抗氧化活性要明顯高于雙孢蘑菇菌絲球提取液的抗氧化活性。

圖4 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液清除能力的比較Fig.4 Superoxide anion’s scavenging capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

表1 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球抗氧化活性各指標EC50值的比較Table 1 Comparison of EC50index of antioxidant activity between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.6 多糖含量的比較

由表2可以看出，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球的多糖含量差異顯著，巴西蘑菇菌絲球的多糖含量達到9.85%，而雙孢蘑菇菌絲球的多糖含量為8.42%。巴西蘑菇菌絲球的多糖含量要比雙孢蘑菇高16.98%。

表2 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球多糖含量的比較Table 2 Comparison of polysaccharides content between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

3 討論

結果表明，巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲球提取液均具有一定的抗氧化活性，且巴西蘑菇的抗氧化活性和多糖含量均明顯要高于雙孢蘑菇。

目前，對食用菌多糖的研究主要集中在其子實體上，研究表明:香菇子實體為3.53%，大杯傘(Clitocybe maxima)子實體為0.23%，金針菇(Flammulina velutiper)子實體為1.65%，茶樹菇(Agrocybe aegirit)子實體為0.92%，雞腿菇(Copyinds comatus)子實體為2.28%［17］，巴西蘑菇子實體多糖含量為 6.34%［18］，雙孢蘑菇多糖含量為3.38%［19］，而對于菌絲體多糖的研究較少。本實驗結果表明:巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體的多糖含量分別為9.85%和8.42%，均高于文獻報道的巴西蘑菇和雙孢蘑菇子實體的多糖含量。巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲體的多糖含量也比香菇、大杯傘、金針菇、茶樹菇和雞腿菇等子實體的多糖含量高。這從一個角度證明了巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體具有很好的開發利用價值。有文獻報道表明采用不同的多糖提取工藝，多糖的提取率會有較大的差異，如平菇破碎法提取多糖得率為11.20%，超聲法提取多糖得率為9.75%，超聲輔助復合酶法提取多糖得率為12.05%［20］，水提法多糖得率為6.48%［21］，說明提取工藝對多糖得率以及多糖含量的測定結果有較大的影響。本實驗只用一種方法對巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體的多糖進行了提取，下一步有必要借鑒對子實體的處理方式嘗試采用其他方法進行多糖提取，或許能進一步提高兩種菌絲體的多糖得率。

對于食用菌抗氧化活性的研究主要集中在子實體及其多糖抗氧化活性上。巴西蘑菇子實體的DPPH·清除能力的EC50值為2.378 mg/mL，還原力的EC50值為2.269 mg/mL，Fe2+螯合能力的 EC50值為2.788 mg/mL［22］，這些數據表明巴西蘑菇子實體的抗氧化性明顯高于巴西蘑菇菌絲體的抗氧化活性。一般來說，食用菌子實體或菌絲體所含的多糖也有較高的抗氧化活性［23－24］，也就是說食用菌子實體或菌絲體的抗氧化活性會受到多糖含量的影響。對于食用菌子實體來說，一般含有較多的活性肽、核苷酸、黃酮類、萜類物質，而這些物質具有較強的抗氧化活性［25］，這些物質也必然會影響到子實體的抗氧化活性。所以，如果要徹底闡明巴西蘑菇子實體的抗氧化活性比菌絲體的抗氧化活性更強的原因，有必要對巴西蘑菇菌絲體的活性肽、核苷酸、黃酮類及萜類等物質進行深入分析。

［1］葉竹秋，林躍鑫.巴西蘑菇抑菌作用的初步研究［J］.食品科學，2001，22(4):82 －84.

［2］李開本，陳體強，徐潔，等.巴西蘑菇富鎘特性研究初報［J］.食用菌學報，1999，6(1):55 －57.

［3］吳素玲，孫曉明，王波，等.雙孢蘑菇子實體營養成分分析［J］.中國野生植物資源，2006，25(2):47－52.

［4］韓建榮，王琪，李斌斌，等.蘆筍老莖培養料對姬松茸產量、多糖含量和抗氧化性的影響［J］.山西大學學報，2012，35(2):405 －409.

［5］呂喜茹，郭亮.姬松茸粗多糖抗氧化作用［J］.食用菌學報，2010，17(1):69 －71.

［6］趙楊帆，鄭寶亮.姬松茸酚類物質抗氧化活性的研究［J］.農產品加工，2008(4):44－46.

［7］Angelova M B，Pashova S B，Spasova B K，et al.Oxidative stress response of filamentous fungi induced by hydrogen peroxide and paraquat［J］.Mycological Research，2005，109(2):150 －158.

［8］Hamedi A，Ghanati F，Vahidi H.Study on the effects of different culture conditions on the morphology of Agaricus blazei and the relationship between morphology and biomass or EPS production ［J］.Annal of Microbiology，2012，62(2):699 －707.

［9］葉斌，周全，唐興國，等.姬松茸搖瓶種子初探［J］.武漢生物工程學院學報，2006，2(2):70－72.

［10］Blois MS.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，181(4617):1 199 －1 200.

［11］Oyaizu M.Studies on products of browning reaction:antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine ［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44(6):307 －315.

［12］Talaz O，Gülcin I，G?ksu S，et al.Antioxidant activity of 5，10－dihydroindeno ［l，2－b］indoles containing substituents on dihydroindeno part［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2009，17(18):6 583 －6 589.

［13］鮑彤華，鐘桂芳.葡萄籽原花色素對超氧陰離子的清除作用［J］.安徽農業科學，2007，35(13):3 782－3 825.

［14］鐘建平，鐘春燕，趙道輝.苯酚－硫酸法測定保健食品多糖的研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2001，11(6):675.

［15］趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究［J］.食品科學，2008，29(8)，534－536.

［16］Ray A A.SAS User＇s Guide:Statistics［M］.Cary，NC:SAS Institute，1985.

［17］林愛琴.幾種食用菌多糖多糖含量的比較［J］.化學工程與裝備，2008(2):4－5.

［18］方建虎，顧順明，周根華，等.姬松茸多糖的測定［J］.食品科學，2004，25(7):142 －144.

［19］吳素玲，孫曉明，王波，等.雙孢蘑菇子實體營養成分分析［J］.中國野生植物資源，2006，25(2):47－48;52.

［20］張敏，陳瑞戰，陳瑞平，等.平菇多糖提取方法的比較［J］.吉林大學學報2011，49(6):1 141 －1 149.

［21］苗永美，王明佳，何華奇.平菇多糖的提取及含量測定［J］.安徽科技學院學報，2010，24(6):29－32.

［22］李斌斌.利用蘆筍老莖栽培姬松茸的研究［D］.太原:山西大學，2011:32 －39.

［23］張強，宮璐嬋，孟凡榮，等.雙孢菇多糖抗氧化活性的研究［J］.中國林副特產，2010(1):16－18.

［24］呂喜茹，郭亮，常明昌，等.姬松茸粗多糖抗氧化作用［J］.食用菌學報，2010，17(1):69 －71.

［25］劉方方，曹暉，許紅星，等.八種常見食用菌的抗過敏和抗氧化活性成分研究［J］.揚州大學烹飪學報，2013(3):32－36.