不同極性紅棗多酚的抗氧化活性比較*

王畢妮，黃慶瑗，高慧，程妮，曹煒

(西北大學化工學院 食品工程系，陜西西安，710069)

紅棗(Ziziphus jujube Mill)為鼠李科棗屬植物，是我國的特色果品之一，具有很高的營養及保健功效，是天然的藥食同源果品，也是我國特有的功能性食品資源。我國紅棗資源豐富，是最大的紅棗出口國，全國紅棗栽培面積在1.5萬hm2以上，每年出口鮮棗達40萬t，約有0.47萬t干棗出口美國，每年創匯收入500萬美元。紅棗不僅營養豐富，還含有多種生物活性物質，如多糖［1］、三萜類［2］、生物堿［3］和多酚類［4－8］等，具有很高的藥用保健價值，作為營養保健品備受人們青睞。多酚是植物體內重要的次生代謝產物，已被證實具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓形成和抗動脈硬化等多種生理功能［9－11］，因其自身的安全性已成為近年來食品科學的研究熱點。

目前對紅棗多酚的抗氧化活性研究多集中于其粗提物的抗氧化活性評價方面，所得提取物純度低，活性低，不利于后期強效多酚保健食品的開發。為增加紅棗多酚提取物中強效多酚的含量，需確定其抗氧化活性部位。已有多項研究報道［12－16］，不同極性溶劑通過液-液萃取的方法可以實現不同極性多酚的分離，從而篩選出強效多酚的存在部位，利于獲取。有關此法分離紅棗多酚尚未見報道。

本研究采用液-液萃取法對紅棗多酚粗提物中不同極性多酚進行分離，并比較不同極性紅棗多酚的提取率、總酚含量及其抗氧化活性，以確定紅棗強效多酚的有效部位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗，購自于陜西佳縣，全紅期采摘，采摘后置于50℃烘干，包裝后置于冰箱保存。

DPPH(1，1苯基-2-苦肼基自由基)、沒食子酸、蘆丁、Trolox(水溶性VE)、TPTZ(三吡啶三吖嗪)，均購自 Sigma公司(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany);其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

721-分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;KQ-100型超聲波清洗機;電子分析天平，北京塞多利斯天平有限公司;低速大容量多管離心機，上海安亭科學儀器廠。

水為超純水(purified by Milli-Q system(Millipore，Bedford，MA，USA))。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同極性紅棗多酚的提取分離

取紅棗5 kg，加入10倍體積分數 80%甲醇溶液，1 000 W超聲室溫下提取30 min，2 000 g離心10 min后收集上清液，殘渣以同樣方法重復提取2次，合并各提取液，35℃下真空濃縮脫除甲醇后，得紅棗多酚粗提液。然后向紅棗多酚粗提液中加入等體積的石油醚，充分振蕩后于分液漏斗中分層，得石油醚層和水層;在水層中再加入等體積的三氯甲烷，振蕩后分層，得三氯甲烷層和水層;同樣的方法，再在水層中依次加入乙酸乙酯和正丁醇，分別得到乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，每種溶劑萃取重復五次。將各極性部位萃取液合并、真空濃縮，水層進行真空冷凍干燥，即可得到不同極性的紅棗多酚提取物。

1.3.2 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法［17］。準確移取適當稀釋的各樣品液0.2 mL，分別加入稀釋1倍的Folin酚試劑0.5 mL，混勻，再加入質量分數10% 的Na2CO3溶液1.5 mL，然后用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，75℃下反應10 min后于760 nm波長處測定吸光值。結果以紅棗各提取物中含有相當沒食子酸的毫克數表示(mg GAE/g)。

1.3.3 總抗氧化能力的測定

采用FRAP(ferric reducing antioxidant power)法［18］。取各樣品液25 μL，加入4.0 mL TPTZ 工作液(由300 mol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ 溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成)，混勻后37℃反應10 min，593 nm測定吸光度，以1.0 mmol/L Trolox為標準，樣品總抗氧化能力以達到同樣吸光度所需的Trolox的量(μmol)表示(μmol Trolox Equivalent(TE)/g)。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

按照Atoui等的方法進行測定［19］。準確移取各樣品液稀釋1倍后，取25 μL于試管中，加入0.1 mmoL/L DPPH溶液4.0 mL，再用蒸餾水定容至10 mL，常溫避光反應30 min后于517 nm波長處測定吸光值。以乙醇作對照，DPPH·清除能力以其清除率表示。各部分粗提物的DPPH·清除率可根據吸光值通過以下公式計算:

DPPH·的清除率/% =(1－A1/A0)×100

式中:A1為樣品組的吸光值，A0為對照組的吸光值。

1.3.5 Fe2+絡合能力的測定

按照Nandita等的方法進行測定［20］。準確吸取樣品溶液1 600 μL，加入1 mmol/L FeSO4溶液200 μL，1 mmol/L Ferozine 試劑 400 μL，并用甲醇定容至4 mL，混勻后反應10 min，在562 nm處測吸收值。以不加樣品溶液為空白對照，以Na2EDTA為陽性對照，結果表示為每克提取物相當于Na2EDTA的毫克數。

1.4 統計分析

所有測得的實驗數據都以3個重復的均值士標準差來表示。數據分析通過SAS(version 8.0)完成。采用Duncan多元回歸方法分析0.05水平上均值的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同極性紅棗多酚的總酚含量

紅棗中多酚成分復雜，采用不同極性有機溶劑萃取可以實現多酚的分離(表1)。萃取溶劑的極性越大，多酚的提取率越高，總酚含量也越高。尤其是水層提取物，多酚的提取率達到32.52%，是乙酸乙酯層的近5倍;其總酚含量也最高，是正丁醇層的3倍多，是乙酸乙酯層的近8倍。可見，紅棗多酚主要以極性酚為主，其具體組成還需進一步深入分析。

表1 不同極性紅棗多酚的提取率及總酚含量Table 1 Extraction rates and total phenolic contents of jujube polyphenols with different polarities

2.2 不同極性紅棗多酚的總抗氧化能力

食品功能活性成分研究的關鍵不是提取出更多的成分，而是得到更多具有高活性的功能成分。因此，在采用不同極性有機溶劑分離多酚時，還需考慮各極性部位提取物的抗氧化活性，以利于后續強效多酚的分離。從圖1可以看出，按照有機溶劑極性由小到大的順序，各極性部位提取物的總抗氧化能力呈遞增的順序。水層多酚提取物的總抗氧化能力(809.941 μmol TE/g)是正丁醇層的2.5倍多，且遠遠強于其他各弱極性部位。

圖1 不同極性紅棗多酚的總抗氧化能力比較Fig.1 Comparison of total antioxidant capacities of jujube polyphenols with different polarities

2.3 不同極性紅棗多酚的DPPH·清除能力

以Vc作為陽性對照，與各極性部位紅棗多酚提取物的DPPH·清除能力的比較結果如圖2所示。由圖2可見，隨著萃取溶劑極性的增強，其提取物的DPPH·清除能力也逐漸增強。其中石油醚層、三氯甲烷層和乙酸乙酯層多酚提取物清除DPPH·的能力顯著弱于等量的Vc(P＜0.05)，正丁醇層不顯著高于Vc(P＞0.05)，而水層提取物的DPPH·清除能力達90%以上，是Vc的2倍多。可見紅棗多酚水層提取物對DPPH·具有很強的清除能力。

圖2 不同極性紅棗多酚的DPPH自由基清除能力比較Fig.2 Comparison of DPPH radical scavenging capacities of jujube polyphenols with different polarities

2.4 不同極性紅棗多酚的Fe2+絡合能力

Fenton反應中，Fe2+能夠催化 H2O2的氧化反應，生成羥基自由基;而多酚類物質可絡合Fe2+，降低Fenton反應的反應速率，進而降低羥基自由基的生成速率，實現其抗氧化作用。如圖3所示，萃取紅棗多酚的有機溶劑的極性越強，其提取物對Fe2+的絡合能力越強。水層多酚提取物的Fe2+絡合能力最強(130.359 mgNa2EDTA/g)，是正丁醇層的2倍多，乙酸乙酯層和三氯甲烷層間無顯著性差異(P＞0.05)，石油醚層最弱，僅為水層的14%。

圖3 不同極性紅棗多酚對Fe2+絡合能力的比較Fig.3 Comparison of complexing capacities to Fe2+of jujube polyphenols with different polarities

2.5 相關性分析

對紅棗中不同極性多酚的總酚含量與其抗氧化活性進行相關性分析，結果發現，總酚含量與各抗氧化活性評價指標均呈一定的正相關性(R＞0.981)，且各抗氧化活性評價指標間也表現較強的正相關(R＞0.992)，表明不同極性紅棗多酚的抗氧化活性主要與其總酚含量有關。

3 結論

不同極性紅棗多酚的提取率、總酚含量和抗氧化活性存在著顯著差異，萃取溶劑的極性越強，總酚含量越高、抗氧化活性越強，即水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞三氯甲烷層＞石油醚層。采用不同極性有機溶劑分級萃取的方法可以使紅棗多酚按極性有效分離，增加萃取溶劑的極性有利于提高強效多酚的含量，可先去除提取物中的弱極性部位，使總酚含量最高、抗氧化活性最強的水層多酚得到富集，以獲得較高抗氧化活性的紅棗多酚，這為高抗氧化活性紅棗多酚的組成分析及分離鑒定奠定了基礎，此部位的其他生物活性還有待于進一步研究。

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