歐洲食品安全局(EFSA)細菌耐藥性評估概述

趙婷，姚粟，徐友強，程池

(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

細菌抗生素耐藥性問題目前引起了國際國內的廣泛關注，成為社會熱點問題［1－3］。2014年，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)根據114個國家的數據進行調查，抗生素耐藥性細菌正蔓延至全球各地［1］。大量不同種類的細菌用于食品或飼料的添加或生產，如發酵劑、益生菌等。這些微生物或微生物的代謝產物最終用于人體和動物，為了避免細菌抗生素耐藥性向人體或動物的轉移風險，必須評估這些微生物菌種的抗生素耐藥性。2002年，國際糧農組織(Food and Agriculture Organization，FAO)和WHO提出食品中益生菌菌種安全性評價應包含抗生素耐藥性檢測［4］。2012年，《美國藥典》(United States Pharmacopeia，USP)和《食品化學法典》(Food Chemicals Codex，FCC)關于包含益生菌的食品微生物菌種附錄XV中，提出在菌種安全性評估方面應包含耐藥性評估［5］。

歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)負責評估微生物菌種的安全性，安全資格認證(Qualified Presumption of Safety，QPS)列表中的微生物菌種，具有長期食用歷史或經EFSA專家組科學評估為食用安全的菌種，其相關產品在特定用途時，上市前不需要再進行廣泛的評估程序。2012年，EFSA更新了相關法規［6－7］，提出了食品及飼料工業用細菌抗生素耐藥性評估體系，為國際范圍內微生物菌種耐藥性評估提供了標準參考方法。2013年，EFSA更新QPS列表［8］，提出將耐藥性鑒定列為微生物菌種通用的安全評估項目，并采用統一的方法進行評估。

1 細菌耐藥性定義

細菌耐藥性指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性。當某一種抗生素耐藥性是細菌物種所固有的特性時，它通常被稱為“固有耐藥性”，有時稱為“自然耐藥性”，即某一物種其所有菌株都具有該典型特性，相反，當一個物種的某個典型敏感菌株對某一種抗生素具有耐藥性，被稱為“獲得性耐藥性”。獲得性耐藥性可能是由于外源基因或原始菌株的自然突變引起［6，9－10］。

2 耐藥性轉移

耐藥性轉移至人或動物，可能源于使用具有耐藥菌株的微生物產品或遺傳因素。基于合理的假設，在開放的環境如腸胃中，基因可以從一種微生物轉移至另外一種微生物，假定固有耐藥性也存在小概率的潛在危害，而插入外源基因的獲得性耐藥性被認為具有很高的潛在危害及傳播風險［10－11］。

外源基因插入是細菌間基因交換的結果。外源基因編碼抗生素耐藥性是存在的，尤其當存在轉座子時，存在較大的耐藥性傳播風險。美國馬里蘭大學抗生素耐藥性基因數據庫ARDB［12］提供抗生素耐藥性基因的檢索、注釋、分析功能，第一版更新至2009年7月，包括抗生素耐藥性基因23 137個，抗生素249種，基因組632個，微生物種1 737個，微生物屬267個。染色體基因突變引起的耐藥性存在較低的耐藥性傳播風險［10－11］。原則上，作為食品或飼料添加劑使用的微生物，應盡可能地選擇具有最低耐藥性的菌株。

3 抗生素選擇

所有用于食品或飼料添加劑的細菌必須建立相關菌株對人體和獸醫上重要抗生素的敏感性數據。另外，測試方法應為國際認可并標準化的方法。抗生素的最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)以mg/L或μg/mL表示，需要測定的抗生素種類包括:氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、萬古霉素、鏈霉素、紅霉素、克林霉素、四環素、氯霉素，在特定的情況下包括泰樂菌素、阿泊拉霉素、萘啶酸、磺酰胺和甲氧芐氨嘧啶(見表1)，這些抗生素涵蓋了廣泛的抗生素種類［8］。

表1 微生物耐藥性截止值(mg/L)Table 1 Microbiological antibiotic resistance cut－off values(mg/L)

4 微生物截止值(cut-off values)

為了從敏感菌株中區分耐藥菌株，EFSA專家組定義了微生物截止值。微生物截止值的設置是通過研究同一個分類單元(種或屬)細菌對不同抗生素耐藥性的MIC值分布而得出。其中的一部分MIC值明顯偏離正常敏感菌株的歸類為耐藥菌株。試驗數據用于定義微生物截止值，如表1所示，數據來自歐洲委員會(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，EUCAST)大量微生物菌種樣本對抗生素敏感試驗［13］，該研究獲得了歐洲監測項目資金支持。

評估這些作為食品或飼料添加劑使用的細菌，菌株可以歸類為對抗生素敏感或耐藥。敏感(S):當菌株被一定濃度的某種抗生素抑制，該濃度等于或低于已建立的截止值(S≤x mg/L)時，該菌株被定義對該抗生素敏感;耐藥(R):當菌株不被一定濃度的某種抗生素抑制，該濃度高于已建立的截止值(S＞x mg/L)時，該菌株被定義為對該抗生素耐藥。

確定的截止值用來從分離菌株中鑒定獲得性耐藥性細菌菌株，并且具有結果的一致性，這些截止值只被用來評估微生物相關產品可能存在的抗生素耐藥性。

5 MIC值測定

為評估細菌菌株對抗生素的耐藥性，采用瓊脂或肉湯進行兩倍梯度稀釋，同時需要質控菌株進行驗證。測試應該執行根據國際公認的標準，如臨床和實驗室標準研究院(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標準［14－16］、國際標準化組織(international organization for standardization，ISO)標準［17］、德國標準化學會(deutsches Institut fǖr Normung，DIN)標準［18］等。經培養后，間接定性或半定性方法來確定MIC值，傳統的瓊脂擴散方法(Kirby-Bauer，KB)通常是不能接受的。現有的科學信息表明，測定特定或相關細菌菌株時必須考慮到MIC值測定程序，如稀釋法、生長培養基和培養條件等，需按照程序操作，避免不同培養基或培養條件對結果造成的干擾。

6 基于遺傳基礎的耐藥性

當檢測MIC值高于截止值，EFSA專家組確定某菌株對一個或更多的抗生素耐藥時，需要進一步調查以確定是否為自然耐藥性。首先，需要區分獲得性耐藥性和固有耐藥性。這只會出現在某分類單元MIC值數據信息有限或缺乏時，在這些情況下，必須闡明菌株的自然結構和基于遺傳基礎的耐藥性，可選擇該分類單元內一些具有代表性的菌株進行分析。因為固有耐藥性是特定于細菌的屬水平或種水平，所以首先需要用分子生物學的方法將菌株鑒定到種水平，當特定分類單元內的所有菌株均顯示對某一抗生素具有表型耐藥性，該耐藥性可被認為是這一分類單元的固有耐藥性。

當一個菌株聲稱與同一分類單元內的其他菌株相比對某一抗生素具有更高的耐藥性時，表明存在獲得性耐藥性，這時，需要基于遺傳基礎的抗生素耐藥性相關信息。唯一的例外是屎腸球菌(Enterococcus faecium)對氨芐青霉素的耐藥性，菌株對氨芐西林MIC＞2 μg/mL時，不適合作為食品或飼料添加劑使用，這是由于醫院對該菌株進行了特殊標記［19］。

獲得性耐藥性可能是由于獲得外源基因或原有基因的突變。現有文獻沒有報道某菌株具有獲得性耐藥基因，并不足以說明該菌株安全。EFSA專家小組提出食品及飼料添加劑菌種的抗生素耐藥性評估方法［8］，如圖1 所示。

任何攜帶固有耐藥性基因的細菌菌株，具有最小的潛在水平傳播風險，因此，可用作食品或飼料添加劑;任何攜帶獲得性耐藥性基因的細菌菌株，如果是由于染色體突變引起的，具有較低的潛在水平傳播風險，一般可用作食品或飼料添加劑;任何攜帶獲得性耐藥性基因的細菌菌株，如果是由于外源獲得性基因引起的，具有極高的潛在水平傳播風險，不能用作食品或飼料添加劑;在缺乏相關基于遺傳基礎的耐藥性信息時，這些菌株不能用作食品或飼料添加劑。

圖1 食品及飼料添加劑菌種耐藥性評估流程Fig.1 Proposed scheme for the antimicrobial resistance assessment of a microorganism used in food or as a feed additive

對于QPS推薦的細菌來說，共同特點是不含耐藥性編碼基因。一般情況下QPS認為攜帶獲得性耐藥性的菌株不能添加到食品和飼料生產過程中，獲得性耐藥基因不完全列表見表2。

7 EFSA細菌耐藥性評估體系對我國相關法規標準的借鑒意義

菌種耐藥性與菌種毒力、菌種致病性等屬于菌種安全性評價范疇［3］。我國在食品微生物菌種耐藥性由國家食品藥品監督管理總局(SFDA)、國家衛生與計劃生育委員會(NHFPC)負責管理，飼料微生物菌種耐藥性由中華人民共和國農業部(MOA)負責管理。

我國出臺的涉及菌種耐藥性評估的法規包括:2001年，衛生部關于印發《真菌類和益生菌類保健食品評審規定的通知》(衛法監發［2001］84 號)［20］第五條:“申報真菌類保健食品，除按衛生部保健食品申報與受理規定的要求提交資料外，還應提供菌種的安全性評價資料(包括毒力試驗)。”2002年，衛生部關于印發《以酶制劑等為原料的保健食品評審規定的通知》(衛法監發［2002］100 號)［21］第二條:“使用微生物發酵直接生產保健食品的，除按保健食品申報與受理的規定提交相關資料外，還需提供菌種的安全性評價報告。”2011年，國家食品藥品監督管理局(SFDA)發布《保健食品良好生產規范(修訂稿)》征求意見(食藥監保化函［2011］548 號)［22］，生產企業進行保健食品產品申報時，應遵循:“菌絲體原料、益生菌類原料和藻類原料采購應當索取菌株或品種鑒定報告、穩定性報告和不含耐藥因子的證明材料。”2013年，衛計委印發《新食品原料申報與受理規定》和《新食品原料安全性審查規程》(國衛食品發〔2013〕23 號)［23］第十二條規定:“安全性評估報告應當包括微生物耐藥性試驗報告和產毒能力試驗報告”等。

表2 獲得性耐藥基因不完全列表Table 2 Acquired antibiotic resistance gene part of the list

我國菌種耐藥性檢測標準包括:WS/T 125－1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標準［24］，SN/T 1944－2007動物及其制品中細菌耐藥性的測定紙片擴散法［25］。兩者均為紙片擴散法，還未出臺最低抑菌濃度法(MIC)耐藥性評估方法標準，更未涉及基因水平耐藥性檢測。

食品安全是國際國內的熱點問題，受到世界范圍內的廣泛關注。用于食品工業的微生物菌種的食用安全性也是其重要組成部分。微生物菌種的安全性評價包括菌種耐藥性、菌種毒力、菌種致病性等。在微生物菌種耐藥性評估方面，歐盟、美國等發達國家在監管、法規、標準、技術體系等方面都位于國際前列，MIC表型檢測與耐藥性基因檢測相結合是食品及飼料微生物菌種耐藥性評估的趨勢，其對我國微生物菌種耐藥性評估體系的規范與發展具有重要借鑒意義。

8 展望

近年來，隨著全基因組測序的發展，基于全基因組測序挖掘、評估微生物菌種耐藥基因也逐漸開展，2011年，丹麥科漢森公司(Chr.Hansen)［26］通過全基因組測序篩查了28株乳酸菌的獲得性耐藥基因及毒力因子基因，2008年，Heimbach等［27］認為蛋白相鄰類聚簇(clusters of orthologous groups，COGs)V可能包含耐藥基因，并分析了羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)DSM 17938全基因組COGs V。國際上已開發出 Etest? 、Neo-Sensitabs? 、Yeastone? 、Vitek? 、MIC T strip、VetMICTM等系列耐藥性檢測商業化衍生產品。我國學者也在中國傳統發酵食品細菌耐藥性評價方面做了有益的嘗試［28－30］，食品種類包括酸奶、腌菜、香腸等，細菌種類涵蓋乳酸桿菌(Lactobacillus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等常見益生菌。課題組2012年采用CLSI M38-A2 MIC方法對保健食品生產菌株產孢小型絲狀真菌蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)進行表型耐藥性評估［31］。面對微生物耐藥性可能引起的食品安全問題，相信未來會有越來越多的學者投入到微生物菌種耐藥性評估研究工作中，EFSA細菌耐藥性評估體系會持續更新，酵母、小型絲狀真菌耐藥性評估體系也會逐步建立，共同保障人類食品安全。

［1］World Health Organization.Antimicrobial resistance global report on surveillance［R］.Switzerl and:WHO，［2014 －04－01］.http://www.whoint/documents/surveillancereport/en/2014.

［2］Marina Pana.Antibiotic resistant bacteria-A continuous challenge in the new millennium ［M］.Rijeka，Croatia:In Tech，2012.

［3］CDC.About antimicrobial resistance:A brief overview.Center for Disease Control and Prevention［R］.Atlanta，Georgia:Center for Disease Control and Brevention，2013，http://www.cdc.gov/drugresistance/about.html

［4］FAO/WTO Guidelines for the evaluation of probiotics in food［C］.London Ontwio Joint，Canada:Food and Agriculture Organization(FAO)/World Health Organization(WHO)，Working Group meeting，2002:5 －1.

［5］USP Food Chemicals Codex 8th edition，Appendix XV:Microbial food cultures including probiotics［M］.Rockville，Maryland.The United States Pharmacopeial Convention，2012:1 709－1 715.

［6］Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance［J］.EFSA Journal，2012;10(6):2 740.

［7］Guidance for the preparation of dossiers for zootechnical additive，EFSA Panel on additvies and products on substances used in animal feed(FEEDAP)［J］.EFSA Journal，2012，10(1):2 536

［8］Liht T R.Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed ［J］.EFSA Journal，2013，11(11):3 449.

［9］Ammor MS，Florez AB，Mayo B.Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and biofidobacteria［J］.Food Microbiology，2007，24(6):559 －570.

［10］Van Reenen CA，Dicks LM.Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota:What are the possibilities?A review［J］.Archives of Microbiology，2011，193(3):157－168.

［11］Devirgiliis C，Barile S，Perozzi G.Antibiotic resistance determinants in the interplay between food and gut microbiota［J］.Genes＆ Nutrition，2011(6):275－284.

［12］Center for Bioinformatics and Computational Biology Onirersity of Maryland Colledge park.Antibiotic resistance(AR)gene database ARDB.http://ardb.cbcb.umd.edu/

［13］The European Committee on Antimicrobial Susceptibility.EUCAST database，http://www.eucast.org

［14］CLSI M100-S21.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twenty-first informational supplement［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2011.

［15］CLSI M38-A2.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi，Approved standard-Second edition［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［16］CLSI M27-A3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved standard-Third edition［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［17］ISO 10932(=IDF 223).Milk and milk products-Determination of the minimal inhibitory concentration(MIC)of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria(LAB)［S］.International Organization for Standardization/the International Dairy Federation，2010.

［18］DIN 58940-7.Medical microbiology-Susceptibility testing of microbial pathogens to antimicrobial agents-Part 7:Determination of the minimum bactericidal concentration(MBC)with the method of microbouillondilution［S］.Deutsches Institut fǖr Normung，2009.

［19］Guidance on the safety assessment of Enterococcus faecium in animal nutrition ［J］.EFSA Journal，2012，10(5):2682.

［20］衛生部關于印發《真菌類和益生菌類保健食品評審規定的通知》［Z］.衛法監發84號，2001.

［21］衛生部關于印發《以酶制劑等為原料的保健食品評審規定的通知》［Z］.衛法監發100號，2002.

［22］國家食品藥品監督管理局(SFDA)發布《保健食品良好生產規范(修訂稿)》征求意見［Z］.食藥監保化函548號，2011.

［23］衛生部印發《新食品原料申報與受理規定》和《新食品原料安全性審查規程》［Z］.國衛食品發23號，2013.

［24］WS/T 125紙片法抗菌藥物敏感試驗標準［S］.中華人民共和國衛生部，1999.

［25］SN/T 1944動物及其制品中細菌耐藥性的測定紙片擴散法［S］.中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2007.

［26］Bennedsen M，Stuer-Lauridsen B，Danielsen M，et al.Screening for antimicrobial resistance genes and virulence factors via genome sequencing［J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77:2 785－2 787.

［27］Heimbach J.Generally Recognized as safe(GRAS)determination of Lactobacillus reuteri strain DSM 17938［Z］.GRAS Notice，2008.

［28］PAN L，HU X，WANG XY.Assessment of antibiotic resistance of lactic acid bacteria in Chinese fermented foods［J］.Food Control，2011，22(8):1 316 －1 321.

［29］ZHOU N，ZHANG JX，FAN MT，et al.Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts［J］.Journal of Dairy Science，2012，95(9):4 775 －4 783.

［30］Nawaz M，WANG J，ZHOU A，et al.Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products［J］.Current Microbiology，2011，62(3):1 081－1 089.

［31］趙婷，姚粟，李輝，等.CLSI M38-A2稀釋法對蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)的藥敏檢測［J］.微生物學通報，2012，39(7):965－970.