蓖麻粕中蓖麻堿的微波輔助提取工藝優化及其抑菌性*

許偉，柯增光，，顏秀花，邵 榮，云志

1(鹽城工學院 化學與生物工程學院，江蘇鹽城，224051)2(南京工業大學化學化工學院，江蘇南京，210009)

蓖麻為大戟科蓖麻屬植物，是世界十大油料作物之一，在世界范圍內廣泛種植［1］。我國是世界第二大蓖麻生產國［2］。蓖麻籽經過壓榨出油后得到的殘渣即為蓖麻粕。蓖麻粕中含有豐富的蛋白和天然活性物質，其中的蓖麻堿［3］具有殺蟲［4］、保肝［5］、鎮痛［6，7］等作用;此外，蓖麻堿還具有中樞神經系統興奮作用，低劑量時對記憶具有一定的改善效果，較大劑量時致驚厥，可作為工具藥制備癲癇動物模型篩選抗驚厥藥［8］。長期以來，蓖麻粕還只是作為肥料用于農田，效益低下［9］。蓖麻粕的有效開發利用對推動蓖麻產業發展、創造經濟效益具有積極作用。本研究采用微波輔助法從蓖麻粕中提取蓖麻堿，通過響應面優化蓖麻堿提取工藝，并初步研究了蓖麻堿的抑菌性，以期為蓖麻堿的高效開發、拓寬利用途徑提供一些基礎科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，都由鹽城工學院生物實驗中心提供;蓖麻籽，購自河北省安國市華仁藥材有限公司。

甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、石油醚(分析純)，購自江蘇彤晟化學試劑有限公司;無水乙醚(分析純)、三氯甲烷(分析純)，購自南京化學試劑有限公司;乙腈(色譜純)，購自美國天地公司;蒸餾水，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

DK-80電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司;RE-2000B旋轉蒸發器，上海雅榮生化設備儀器有限公司;752紫外可見分光光度計，上海佑科儀器有限公司;XO-SM50超聲波微波組合反應系統，南京先歐生物科技有限公司;P230Ⅱ高效液相色譜，大連依利特有限公司;AUY220電子天平，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓖麻粕制備

將蓖麻籽粉碎，加入V(乙醚)∶V(石油醚)=3∶1的混合溶劑，固液比為1∶3(g∶mL)，機械攪拌1h，將固-液混合物進行分離，干燥后得到脫脂蓖麻粕。

1.3.2 蓖麻堿標準曲線的繪制

準確稱取25 mg蓖麻堿純品，甲醇溶解定容在25 mL 容量瓶中，準確吸取上述溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分別定容在10 mL的容量瓶中，高效液相色譜法測峰面積。以蓖麻堿的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 蓖麻粕中蓖麻堿含量測定

準確稱取蓖麻粕20 g，按1∶10(g∶mL)的料液比加入蒸餾水，在微波功率400 W下提取5 min，過濾，濾液濃縮至膏狀，轉移至索氏抽提器中，加入三氯甲烷150 mL，在90℃下回流提取3 h，蒸出溶劑，甲醇充分溶解并定容至50 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜分析，記錄峰面積。將分離得到的蓖麻粕重復上述操作，直至峰面積小于500 mV·sec，將所有峰面積相加，帶入標準曲線計算得到蓖麻堿的質量濃度c，然后根據下式計算蓖麻堿含量。

式中:y為蓖麻堿含量，%;c為依據標準曲線計算出的待測蓖麻堿質量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質量，g。

1.3.4 蓖麻堿提取率計算

式中:η為蓖麻堿提取率，%;c為依據標準曲線計算出的待測蓖麻堿質量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質量，g;y為蓖麻堿含量，%。

1.3.5 單因素實驗

以蓖麻堿提取率作為考察指標，通過單因素實驗分別研究微波功率(100，200，300，400，500，600 W)、液固比(2，4，6，8，10，12 mL/g)和提取時間(1，2，3，4，5，6 min)對蓖麻堿提取率的影響，初步確定適宜提取蓖麻堿的相應水平范圍。每個處理3次平行實驗，取平均值。

1.3.6 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，選取微波功率、液固比和提取時間3個因素，采用三因素三水平響應面分析的方法優化蓖麻堿提取工藝，實驗因素和水平表設計見表1。每個處理平行實驗3次，取平均值。所得實驗數據采用Design Expert8.0軟件進行分析。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 蓖麻堿的抑菌性研究

1.3.5.1 菌種的活化及菌懸液的制備［10］

將3種供試菌分別接入到已滅菌的斜面上，于37℃恒溫培養箱中培養24 h。分別挑取一環已活化好的菌種接種到裝有50 mL LB液體培養基中，置于恒溫培養搖床(160 r/min、37℃)中培養12 h，然后用無菌生理鹽水將3種菌稀釋至濃度約5×106～5×107CFU/mL的菌懸液。

1.3.5.2 抑菌性實驗

蓖麻堿的抑菌性實驗采用參考文獻［11－12］中的方法并略作修改。取直徑為6 mm的濾紙片于121℃、0.1 MPa下濕熱滅菌20 min備用。將已滅菌的濾紙片分別放入濃度為10、5和2.5 mg/mL的蓖麻堿溶液中浸泡30 min。將每個培養皿內倒入15 mL已滅菌的固體培養基，待培養基凝固后，各取供試菌液0.2 mL分別涂布在固體培養基上，制成含菌平板，每種菌的平板貼3片浸過不同濃度的蓖麻堿溶液的濾紙片和1片浸過生理鹽水的濾紙片，對稱放置。置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值，比較蓖麻堿對各種菌的抑菌性。每種菌做3組平行實驗。

2 結果與分析

2.1 蓖麻堿標準曲線的繪制

以蓖麻堿的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，其標準曲線回歸方程為y=21 654.48x+666.08，相關系數R2為0.998，呈現良好的線性關系。

2.2 蓖麻堿含量測定

重復測定3次，蓖麻堿含量平均值為0.164 1%，相對標準偏差(RSD)為0.38%，實驗結果重復性較好。

表2 蓖麻堿含量測定Table 2 Ricinine content determination

2.3 微波輔助提取蓖麻堿的單因素實驗

2.3.1 微波功率對蓖麻堿提取率影響

微波功率對蓖麻堿提取率的影響見圖1。

圖1 微波功率對蓖麻堿提取率影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of ricinine

由圖1可以看出，當微波功率較小時，隨著微波功率的增加，蓖麻堿的提取率上升，當微波功率達到400 W后，蓖麻堿的提取率開始下降。可能是隨著微波功率增加，微波的熱效應增強，提取液的溫度升高，增加了固液擴散速度，提高了提取率;但是當功率過大，使升溫速度過快，可能導致提取液爆沸，造成了提取液的損失，而且功率增加也會增加能耗［13］。因此最適的微波功率為400 W。

2.3.2 液固比對蓖麻堿提取率影響

液固比對蓖麻堿提取率的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著液固比的增加，蓖麻堿提取率逐漸上升，液固比超過10后，蓖麻堿提取率幾乎不發生變化。可能是因為溶劑量增大后，濃度梯度變大，有利于蓖麻堿的溶出;液固比超過10后，再增加液固比，蓖麻堿的提取率也不再增加，表明提取已達到平衡［14］。因此最適的液固比為10。

圖2 液固比對蓖麻堿提取率影響Fig.2 Effect of material to solvent on the extraction rate of ricinine

2.3.3 提取時間對蓖麻堿提取率影響

提取時間對蓖麻堿提取率的影響見圖3。由圖3可以看出，隨著微波提取時間的延長，蓖麻堿提取率逐漸提高，當提取時間達到5 min時，蓖麻堿的提取率達到最大值，再延長提取時間，蓖麻堿提取率開始下降。可能是隨著提取時間的不斷延長，環境溫度不斷上升，促進了溶質的浸出，當提取時間超過5 min時，環境溫度過高，使溶劑沸騰，溶劑量減少，溫度過高也可能導致蓖麻堿分解［15］。因此最適的提取時間為5 min。與傳統提取方法［16］(熱水提取時間一般為3～4 h)相比，微波提取法顯著縮短了蓖麻堿的提取時間。

2.4 響應面實驗結果與分析

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

響應面實驗設計及結果見表3。運用 Design Expert8.0軟件對表3中的17個實驗數據進行回歸分析，擬合后得到關于微波功率(W)、液固比(mL/g)和提取時間(min)的二次多項式回歸模型為:

蓖麻堿提取率Y%=49.10+0.14 X1+2.53 X2－0.44 X3+0.66 X1X2－2.83 X1X3+1.29 X2X3－

圖3 提取時間對蓖麻堿提取率影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of ricinine

表3 響應面實驗結果Table 3 Results of response surface experiment

該回歸模型及模型系數顯著性驗證結果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該模型極其顯著(P值＜0.000 1)，決定系數R2值為0.998 3，表明該模型蓖麻堿提取率的實驗值和擬合值之間具有很好的擬合度。該模型的失擬項P值＞0.10，表明二次模型是合適的。對模型系數顯著性分析可知，因素X1對蓖麻堿提取率的影響不顯著，X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X2和X2對蓖麻堿提取率的影響顯著。因素的P值越小，對蓖麻堿提取率的影響越顯著。一次項中各因素對蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時間(X3)＞微波功率(X1)。

2.4.2 響應面實驗中各因素交互作用影響

響應面優化蓖麻堿提取實驗中液固比和微波功率對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖4。從圖4可以看出，提取時間處于最佳值時，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達到穩定。

圖4 微波功率和液固比對蓖麻堿提取率的響應曲面圖Fig.4 Response surface of microwave power，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

響應面優化蓖麻堿提取實驗中微波功率和提取時間對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖5。

圖5 微波功率和提取時間對蓖麻堿提取率的響應曲面圖Fig.5 Response surface of microwave power，solvent-to-material extraction time on the extraction rate of ricinine

從圖5可以看出，液固比處于最佳值時，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著提取時間的延長先升高后降低。

響應面優化蓖麻堿提取實驗中液固比和提取時間對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖6。從圖6可以看出，微波功率處于最佳值時，蓖麻堿提取率隨著提取時間的延長先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達到穩定。

圖6 提取時間和液固比對蓖麻堿提取率的響應曲面圖Fig.6 Response surface of extraction time，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

2.4.3 回歸模型驗證

經過Box-Behnken設計得到微波提取蓖麻堿最優工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下蓖麻堿的提取率為50.74%。

考慮到實際操作的便利，將蓖麻堿的最優工藝條件修正為:微波功率408 W，提取時間5.2 min，液固比12(mL∶g)。在此條件下進行驗證實驗，得到蓖麻堿的提取率為50.81%，相對偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。

2.5 蓖麻堿抑菌性結果

蓖麻堿對各種菌的抑菌作用見圖7。由圖7可知，蓖麻堿對大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，且隨著蓖麻堿的濃度增加而增強。蓖麻堿對各菌種的抑菌效果為:大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

圖7 蓖麻堿對各種菌種的抑菌作用Fig.7 Antibacterial activity of ricinine on different strains

3 結論

本實驗以蓖麻粕為原料，以水為提取溶劑，采用微波輔助提取蓖麻堿，在單因素實驗的基礎上，通過響應面優化了蓖麻堿提取工藝，得到微波提取蓖麻堿的最佳工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下獲得蓖麻堿提取率的理論值為50.74%，通過驗證實驗得到實際提取率為50.81%，相對偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。通過方差性分析可知各因素對蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時間(X3)＞微波功率(X1)。采用微波輔助提取法具有比傳統提取方法時間短的特點。采用濾紙片法測定蓖麻堿的抑菌性，結果表明蓖麻堿對大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，蓖麻堿對各菌種的抑菌效果為大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

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