降糖三黃片對早期糖尿病腎病大鼠腎組織TGF－β1/Smad1信號通路的影響

江 丹 吳 偉 林明欣 朱章志

(1廣東省第二中醫院，廣州，510095;2廣州中醫藥大學，廣州，5104053;3中國中醫科學院，北京，100700;4廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州，510405)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發癥之一，糖尿病病程25年以上患者中DN的累積患病率為25% ～40%[1]。DN是導致終末期腎病(End Stage Renal Disease，ESRD)的重要原因，已經嚴重威脅糖尿病患者的生命健康。ESRD需要透析治療，在歐洲發達國家20% ～40%的糖尿病患者最終發展為DN，成為透析治療患者的首要原因[2]。雖然DN的發病機制非常復雜，但是學界對于DN腎臟病變的發生和發展與一些細胞因子和生長因子作用密切相關的學說，已基本取得了共識。在生長因子和細胞因子中作用最為突出的是轉化生長因子－β1(Transforming Growth Factor－ β1，TGF－ β1)，它能夠調節細胞及基質生長、分化，刺激細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)的分泌。Smads家族蛋白是將 TGF－β信號從細胞表面受體轉導至細胞核的過程中起關鍵作用的蛋白。TGF－β/Smad信號通路最終會形成低聚體復合物，激活核內ECM成分如各型膠原Col－Ⅰ、Col－Ⅳ、纖維粘連蛋白(FN)等啟動子的活性，從而增加ECM合成，導致腎纖維化。

降糖三黃片以桃核承氣湯為底方，加黃芪、生地黃、玄參、麥冬等藥物組成，具有益氣養陰、泄熱逐瘀的作用，對2型糖尿病及其并發癥具有一定的療效。在對糖尿病多種慢性并發癥的研究中，本課題組發現加味桃核承氣湯能改善DN患者糖、脂代謝紊亂，減少24 h尿蛋白排泄量、提高內生肌酐清除率[3]，減輕或延緩糖尿病鼠腎小球毛細血管基底膜的增厚[4]。降糖三黃片能改善胰島素抵抗、降低DN大鼠尿蛋白、AngⅡ含量，抑制 DN 大鼠 PKC[5]和 TGF－ β1 的過度表達[6]，從而減少腎小球ECM的積聚，起到保護腎臟的作用。本研究的目的是通過大鼠實驗觀察降糖三黃片對血糖、24 h尿微白蛋白;TGF－ β1、Smad1、Co1－ Ⅳ的影響，以進一步研究其對ECM的影響及機制，為該方對DN的臨床運用提供更加充分的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品、試劑及儀器 降糖三黃片為廣州中醫藥大學院內制劑(批號:粵藥制字Z20071185);厄貝沙坦片(賽諾菲杭州制藥有限公司，進口藥品注冊證號:H20080074);鏈脲佐菌素(Streptozin，STZ，美國 Sigma公司);配制pH 4.2，0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。葡萄糖試劑盒(上?？菩郎锛夹g研究所);TGF－β1采用ELASA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。尿微量白蛋白用全自動生化分析儀測定;Smad1 pAb抗體試劑盒(Bioword技術公司);Anti－Smad3 Antibody試劑盒、Anti－CollagenⅠ Antibody試劑盒及Anti－CollagenⅣantibody試劑盒(Abcam技術公司);DAB顯色液、UltraSensitiveTMS－P超敏試劑盒(福建邁新生物技術開發有限公司)。TRIzol(批號:28223)、M－MLV First Strand Kit(批號:8212242)、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix－UDG(批號:8212208)均由美國Invitrogen公司提供。特異性引物(上海英濰捷基貿易有限公司)。IQTM5型熒光定量PCR儀、SmartSpec Plus核酸蛋白測定儀(美國Bio－Rad公司)、Milli Q Plus超級純水儀(美國Millipore公司)、BX51型光學顯微鏡(日本 Olympus)、MSHOT數碼成像系統(MC－20，廣州市明美光電技術有限公司)、MIAS醫學圖像分析管理系統(北京航空航天工業大學)。

1.2 DN動物模型的復制 SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。飼養于廣東省中醫藥工程技術研究院SPF級動物實驗室，溫度21～24℃，濕度50% ～70%，雌雄分籠飼養，每籠4～5只;喂食SPF級鼠飼料，飲用無菌水。適應性喂養2周后，按隨機數字表分為2組，空白對照組(正常組)11只，造模組69只。造模前禁食12 h，造模組按30 mg/kg劑量腹腔內注射STZ，正常組腹腔內注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后各組大鼠眼眶靜脈采血測定空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，且出現多飲、多尿、多食現象，確認為2型糖尿病模型。繼續喂養8周至出現糖尿病大鼠的腎損害(電鏡結果為證)。

1.3 分組、給藥及喂養 造模成功的大鼠按隨機數字表進一步分為模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組。灌胃前用純凈水配制成1 mL混懸液配制藥品(實驗動物與人用藥量換算公式:大鼠用量=生藥量×0.018×5)。厄貝沙坦組0.027 g·kg－1·d－1劑量灌胃，1 次/d;降糖三黃片組 0.675 g·kg－1·d－1的劑量灌胃，1次/d;正常組及模型組灌服等劑量蒸餾水。給藥8周后處死。中途死亡或不符合條件不列入統計分析，共35只大鼠完成實驗，正常組10只，模型組8只，厄貝沙坦組9只，降糖三黃片組8只。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般生化指標檢測 分別在治療前、給藥后4周、8周處死前稱體重和眼眶靜脈竇采血檢測葡萄糖。于DN造模成功后、處死前，分別用代謝籠收集24 h尿液計算尿微量蛋白排泄量。處死后摘取腎臟，右側腎臟去包膜稱重，計算腎重/體重指數(腎重÷體重×100%)。取左側腎臟一部分，用10%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，以便進行免疫組化分析;另一部分置－80℃冰箱中保存備用。

1.4.2 測定腎組織TGF－β1含量 取部分大鼠腎組織，采用雙抗體夾心ELASA法測定TGF－β1含量。計算OD值，使用軟件作圖，根據樣品OD值計算出相應TGF－β1含量。本次實驗 TGF－β1公式:R2=0.985 6，y=－7E－08x2+0.000 3x+0.068 1。

1.4.3 檢測腎組織Smad1、Col－Ⅳ免疫組化染色表達取石蠟切片，用二步法免疫組化染色檢測腎組織Smad1、Col－Ⅳ表達。取200倍顯微鏡視野，以出現棕黃色顆粒為陽性性號，用MIAS醫學圖像分析管理系統進行統計分析。

1.4.4 熒光定量RT－PCR法檢測腎組織Smad1、Col－Ⅳ基因表達量 取腎組織100 mg，液氮下研磨，然后加入1 mL TRIzol試劑，混勻后轉移到1.5 mL離心管中，在室溫下放置5 min。然后在4℃下12 000 r/min，離心10 min。取出上清液，轉入新的1.5 mL離心管中，加入1/5體積的氯仿，用力混勻2 min，4℃下12 000 r/min，離心10 min。上清液轉移到新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，放入－20℃冰箱靜置0.5 h。取出后在4℃下12 000 r/min，離心10 min。棄上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗滌2次后，在室溫下干燥10 min。最后用200 μL滅菌超純水溶解沉淀，并且用核酸蛋白測定儀測定OD260/OD280比值，算出RNA的濃度和純度。反轉錄的操作按照Invitrogen公司MMLV First Strand Kit提供的實驗方法進行，加入上述提取的總RNA，合成第一鏈cDNA。根據GenBank提供的基因序列設計特異性引物，引物設計利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物軟件，用于擴增內參18S(GenBank Accession no.M11188)以及Col－I(GenBank Accession no.NM_053304)，Col－ IV(GenBank Accession no.NM_001135009)，Smad1(GenBank Accession no.NM_013130)，Smad3(GenBank Accession no.NM_013095)。設計的引物序列如下:18S引物:R(5'－3'):CAGACTTGCCCTCCA、F(5'－ 3'):ACGGCTACCACATCC;Col－I引物:F(5'－3'):CGATGGCGTGCTATGC、R(5'－3'):ACTTCTGCGTCTGGTGATA;Col－IV 引物:F(5'－3'):TACCTCACTGTCCACTATG、R(5'－3'):CTGTCTGTCCTTCTCCTT;Smad1引物:F(5'－3'):CGTGTTGGTGGATGGT、R(5'－ 3'):GATGTGTCGCCTGGTAT;Smad3 引物:F(5'－3'):ACTACAGCCATTCCAT、R(5'－3'):TTCTCCATCTTCACTCA.基因表達的檢測按照所示組分進行添加，然后放入熒光定量PCR儀進行反應。將上述反應混合物放入PCR儀進行擴增。步驟1:94℃ ×5 min;步驟2:94℃ ×30 s→55℃ ×30 s→72℃ ×50 s(45個循環);步驟3:72℃ ×7 min。每組10個樣品，分別取1 μL作為cNDA模板擴增，運用2－△△Ct法計算各組基因相對表達量。具體計算公式為:F=2－[(待測組目的基因平均Ct值－待測組內參基因平均Ct值)－(對照組目的基因平均Ct值－對照組內參基因平均Ct值)]

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包分析系統，實驗所得數值以均數加減標準差(±s)表示。多組間均值比較采用單因素方差分析，或重復測量設計的方差分析。若方差齊，組間均值兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，改用Dunnett T3檢驗，α=0.05。

2 結果

2.1 一般生化指標比較 血糖比較:治療前及治療后第4周，正常組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01);厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。正常組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)。治療后第8周，正常組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)，厄貝沙坦組與模型組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)。表明STZ造模后各組血糖明顯升高，但相對于模型組、厄貝沙坦組，表明降糖三黃片能一定程度降低血糖，減輕高糖毒性(見表1)。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較(±s)

表1 各組大鼠治療前后血糖比較(±s)

注:兩兩比較用Dunnett T3檢驗。與模型組相比，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數 血糖(mmol/L)治療前 4周 8周正常 10 4.96±0.86＊＊△△ 5.24±0.87＊＊△△ 7.04±1.28＊＊△△0.000 0.000 0.000模型 8 29.42±3.89 39.78±4.45 50.30±5.51厄貝沙坦 9 26.04±3.92 36.59±5.03 47.08±6.14降糖三黃片 8 24.77±4.30 34.53±5.93 38.26±5.09＊＊△△F值 98.35 126.91 161.13 P值

治療前各組體重比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。造模后4周、8周體重比較:正常組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01);厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

腎重/體重指數比較:正常組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)，厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，降糖三黃片與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。腎重/體重指數比增大表明造模后各組大鼠均有存在腎肥大、腎損傷的情況，降糖三黃片與厄貝沙坦同樣具有減輕腎臟肥大的作用(見表2)。

表2 各組大鼠治療前后體重、腎重/體重指數比較(±s)

表2 各組大鼠治療前后體重、腎重/體重指數比較(±s)

注:體重用兩兩比較用LSD法。腎重/體重指數用兩兩比較用Dunnett T3檢驗。與模型組相比，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數 體重(g)造模前 造模后4周 8周 腎重(g) 腎重/體重正常 10 194.05±13.39 230.13±12.27＊＊△△ 261.91±18.11＊＊△△ 0.87±0.06 0.00332±0.00017＊＊△△模型 8 194.00±7.57 166.05±11.39 152.11±21.11 0.91±0.05 0.00609±0.00073厄貝沙坦 9 196.22±11.15 175.41±18.57 157.53±21.91 0.84±0.11 0.00534±0.00048降糖三黃片 8 198.13±8.63 168.96±14.77 161.66±11.89 0.84±0.08 0.00521±0.00061 F值 0.29 40.9 74.7 1.669 47.157 P值0.832 0.000 0.000 0.194 0.000

治療前各組尿微量白蛋白比較差異無統計學意義(P＞0.05)。治療后第8周，正常組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)，正常組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)，降糖三黃片與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。表明降糖三黃片能有效降低早期DN大鼠尿微量白蛋白，從而保護腎功能，且療效與厄貝沙坦片接近(見表3)。

表3 各組大鼠治療前后尿微量白蛋白比較(±s)

表3 各組大鼠治療前后尿微量白蛋白比較(±s)

注:兩兩比較用LSD法。與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△△P＜0.01。

組別 例數 尿微量白蛋白(mg/24 h)治療前 8周正常 10 29.34±14.13 43.29±22.53＊＊△△0.628 0.000模型 8 24.62±10.18 403.28±134.09△△厄貝沙坦 9 23.55±10.66 245.74±130.43＊＊降糖三黃片 8 23.81±6.29 235.06±87.31*F值 0.59 19.02 P值

2.2 測定腎組織TGF－β1含量 治療后第8周，正常組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組TGF－β1含量與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P＞0.05)(見表4)。

2.3 檢測腎組織Smad1、Col－Ⅳ免疫組化染色表達

光鏡下免疫組化染色顯示smad1陽性表達部位為腎小管上皮細胞胞質。正常組呈弱陽性表達(見圖1A);模型組呈陽性表達增強，陽性顆粒為棕黃色(見圖1B);厄貝沙坦組和降糖三黃片組比模型組陽性表達程度顯著減弱(見圖1C、圖1D)。

Smad1染色指數比較:正常組、模型組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P=0.08)(見表4)。

圖1 腎組織Smad1

光鏡下免疫組化染色顯示Col－Ⅳ陽性表達部位為腎小球毛細血管和腎小管基底膜。正常組呈陽性表達(見圖2A);模型組陽性表達增強，陽性顆粒為棕黃色(見圖2B);厄貝沙坦組和降糖三黃片組比模型組陽性表達程度減弱(見圖2C、圖2D)。

圖2 免疫組化染色表達

表4 各組大鼠治療后TGF－β1含量、Smad1染色指數、Col－Ⅳ染色指數比較(±s)

表4 各組大鼠治療后TGF－β1含量、Smad1染色指數、Col－Ⅳ染色指數比較(±s)

注:兩兩比較用LSD法。與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與厄貝沙坦比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

組別 例數 TGF－β1(pg/mg) 染色指數=平均光密度值×面密度值Smad1 Col－Ⅳ正常 10 265.23±84.49＊＊△△ 0.0382±0.0115＊＊△0.0529±0.0147＊＊△0.000 0.000 0.000模型 8 694.21±153.94△△ 0.0800±0.0164△△ 0.0849±0.0125△厄貝沙坦 9 429.87±146.60＊＊ 0.0565±0.0109＊＊ 0.0704±0.0132*降糖三黃片 8 390.86±100.91＊＊ 0.0599±0.0204* 0.0648±0.0156＊＊F值 18.372 11.734 7.876 P值

Col－Ⅳ染色指數比較:正常組、模型組、降糖三黃片組與模型組相比差異具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義(P=0.076)(見表4)。

3 討論

TGF－β的分布有一定的組織特異性，腎臟以TGF－β1為主，主要在腎小管上皮細胞，其次是腎小球。TGF－β1可直接刺激FN、Col－Ⅰ型和Col－Ⅳ的形成，體外細胞培養表明持續或間斷的高糖環境可促使TGF－β1的產生和活化，TGF－β1可誘導 I、Ⅲ、Ⅳ型膠原及FN的表達[7]。此外，TGF－β1還能破壞腎小球濾過屏障，參與炎性反應、組織修復，促使腎小球硬化和腎間質纖維化，而這正是DN腎臟損害的基本病理機制[8]。本實驗結果顯示:造模后各組TGF－β1與正常組相比差異具有統計學意義 (P＜0.01)，正常組、模型組與厄貝沙坦組相比差異具有統計學意義 (P＜0.01);表明STZ造模后大鼠TGF－β1含量增加，而降糖三黃片、厄貝沙坦均能明顯抑制DN大鼠腎組織中TGF－β1的表達，與既往研究結果一致[3]。

Smads家族蛋白是參與TGF－β超家族在細胞內信號轉導的一組蛋白質，迄今為止，在哺乳動物已經分離鑒定的Smad蛋白有9種。Smads家族按功能可分成3類[9]:1)受體活化性或通路限制性 Smad(RSmads)，由于可以由活性的TβR激活發生磷酸化而得名，是專門轉導 TGF－β家族中某條信號通路的Smad;2)共配偶體Smad，它是TGF－β族各類信號轉導過程中共同需要的介質;3)抑制性Smad，它們也可與Ⅰ型受體結合，結合反應的穩定性比受體激活型Smad更強，因而限制受體激活型Smad被磷酸化，抑制信號轉導過程。其中 Smad1作為 R－Smads，參與BMP信號轉導，影響 Col－ Ⅳ表達[10]。Matsubara等[11]在體外證實了高糖狀態下Smad1能夠轉錄調節Col－Ⅳ的表達;同時證實，STZ誘導的糖尿病大鼠在24周時表現出程度不等的腎小球硬化;通過Western blot和免疫組化檢測及相關性分析證實大鼠腎小球Smad1的表達水平與腎小球硬化的程度呈明顯正相關，且與腎小球Col－Ⅳ和α平滑肌肌動蛋白(α－SMA)的表達密切相關。本實驗治療后第8周smad1基因表達量比較:模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與正常組相比有升高(P＜0.05)，厄貝沙坦組、降糖三黃片組與模型組比較降低(P＜0.05)。降糖三黃片組與厄貝沙坦組相比，P=0.08，雖無統計學意義，但分析數據考慮接近0.05，可能與實驗例數過少有關，若增大例數重新統計，可能有統計學意義。

Col－Ⅳ是構成ECM的重要生化成分，也是腎小球基底膜(Glomerular Basement Membrane，GBM)的主要構成蛋白，約占GBM干體質量的50%，可決定GBM的強度及孔徑選擇性，故Ⅳ－C合成和降解異常勢必影響腎臟結構與功能，DN時腎臟的Ⅳ－C表達增加[12]。Ziyadeh等證實體外高糖培養的腎近曲小管細胞和系膜細胞均有TGF－β1 mRNA表達及生物活性增加，同時分泌col－Ⅰ及col－Ⅳ增多，這種變化能被抗TGF－β1抗體抑制[13]。本實驗治療后第8周Col－Ⅳ基因表達量比較:模型組、厄貝沙坦組、降糖三黃片組與正常組相比有升高 (P＜0.05)，厄貝沙坦組與模型組比較降低有統計學意義 (P＜0.05);降糖三黃片組與模型組相比有下降，P=0.076，雖無統計學意義，但分析數據考慮接近0.05，可能與實驗例數過少有關，若增大例數重新統計，可能有統計學意義。

中醫認為糖尿病早期常有多飲、多食、多尿、大便干結或便秘等“胃腸燥熱”的癥狀。發展至早期DN時，因大量蛋白從尿中丟失，出現尿濁 (蛋白尿);除此，多伴有血脂代謝紊亂、疲倦、肢麻等表現。早期DN病機以氣陰兩虛為本，胃腸燥熱為標，兼夾痰濕、瘀濁[14]。從《傷寒論》六經辨證，提出DN當屬五行中的“土”病及“水”病，因胃屬于陽明，腎屬于少陰。為陽明、少陰病熱證，宜破血下瘀，急下存少陰之津，以求瀉土布津。因降糖三黃片具有益氣養陰、泄熱逐瘀的作用，故用于早期DN治療。研究結果表明降糖三黃片具有明顯降低血糖、尿微量白蛋白的作用，與既往采用加味桃核承氣湯水煎劑灌胃治療的結論一致[3]。降糖三黃片還可通過抑制腎組織TGF－β1/smad1通路的表達，降低Col－Ⅳ的沉積，使腎臟的異常結構得到改善，降低腎重/體重指數比，延緩腎小球硬化。推測降糖三黃片可能是通過改善糖脂代謝紊亂，降低腎組織AngⅡ水平[5];同時，通過增加胰島素敏感性[15]，降低血糖，減少AGEs沉積，從而抑制TGF－β1表達，抑制腎小管細胞肥大及腎間質成纖維細胞合成ECM，達到保護腎功能延緩DN發展的目的。這一結論是對降糖三黃片療效的肯定，為臨床應用降糖三黃片治療早期DN提供了分子生物學理論依據。

[1]Atsuhiro Ichihara，Mariyo Sakoda，Asako Mito－ Kurauchi，et al.Activated prorenin as a therapeutic target for diabetic nephropathy[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2008，82(1):S63－ S66.

[2]Dronavalli S，Duka I，Bakris GL.The pathogenesis of diabetic nephropathy[J].J Nat Clin Pract Endocrinol Metab，2008，4(8):444－452.

[3]王廷春，范冠杰，歐翠柳.加味桃核承氣湯治療糖尿病腎病138例臨床觀察[J].國醫論壇，2000，15(2):10－12.

[4]熊曼琪，苗理平.加味桃核承氣湯對糖尿病鼠腎超微結構的影響[J].中國醫藥學報，1990，5(5):25－27.

[5]陳云，李賽美，王保華.降糖三黃片對糖尿病腎病大鼠腎組織蛋白激酶C和轉化生長因子β1的影響[J].中醫雜志，2012，53(8):689－692.

[6]陳云，李賽美，王保華.降糖三黃片對糖尿病大鼠腎臟轉化生長因子－β1表達的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2012，29(2):154－159.

[7]Poneelet AC，Schnaper HW.Regulation of human mesangial cell collagen expression by transforming growth factor－ betal 1[J].Am J Physiol，1998，275(3Pt2):F458－466.

[8]Wolf g，Ziyadeh FN，Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy[J].Kidney Int，1999，56(2):393－405.

[9]馬云，肖煒，候連兵.轉化生長因子－β信號通路與糖尿病腎病[J].第二軍醫大學學報，2005，26(11):1293－1296.

[10]Hideharu Abe，Takeshi Matsubara，Noriyuki Iehara，et al.Type IV collagen is transcriptionally regulated by Smad1 under advanced glycation end product(AGE)stimulation[J].J.Biol.Chem，2004，279(14):14201－14206.

[11]Matsubara T，Abe H，Aria H，et al.Expression of Smad1 is directly associated with Mesantial matrix expansion in rat diabetic nephropathy[J].Lab Invest，2006，86(4):357－368.

[12]LIU Y，WANG Z，Y IN W，et al.Severe insulin resistance and moderate glomeruloselerosis in a minipig model induced by high－fat/high－sucrose/high－ cholesterol diet[J].Exp Anim，2007，56(1):11－ 20.

[13]Ohashi S，Abe H，Takahashi T，et al.Advanced glycation end products increase collagen－specific chaperone protein in mouse diabetic nephropathy[J].J Biol Chem，2004，279(19):19816－19823.

[14]蘇克雷，朱垚，郭立中.國醫大師周仲瑛治療糖尿病腎病經驗[J].中華中醫藥雜志，2012，27(11):2854－2857.

[15]熊曼琪，林安鐘，朱章志，等.加味桃核承氣湯對Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].中國中西醫結合雜志，1997，17(3):165－168.