HBeAg轉陰與HBV 基因型分布和YMDD 變異位點的相關性分析

吳艾霖，熊怡淞，王艷艷，曲遠青，段小剛，吳麗娟（成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實驗醫(yī)學研究與保障中心，成都 610083）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的具體情況差異很大。據(jù)相關研究報道顯示，我國有1億以上的HBV 感染或攜帶者［1－2］。乙型肝炎的實驗室檢測主要有血清學、病毒學、生物化學試驗等，有效治療策略也主要集中于藥物抗病毒治療，并將乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）血清學轉陰作為停藥的指標。但近年來臨床觀察發(fā)現(xiàn)，HBeAg血清學轉陰患者停藥后，也有較高的復發(fā)率，所以將血清學轉陰作為停藥的指標并不恰當［3－4］。HBeAg血清學轉陰的原因較為復雜，主要涉及患者自身免疫功能缺陷或轉換、病毒自身原因等，但由于患者自身的因素較為復雜且個體差異較大［5］。所以本研究擬從病毒自身原因的角度探討HBeAg血清學轉陰、HBV 基因型和YMDD 變異位點3者的相關性，為制定HBeAg血清學轉陰的乙型肝炎患者的檢測策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院2010年1月至2012年12月就診的1200例乙型肝炎患者作為研究對象，其中男798例，女402例；年齡5～76歲，平均39.2歲。所有患者HBeAg血清學檢查轉陰577例，623例HBeAg 血清學檢查未轉陰；排除合并甲、丙、戊、庚肝及自身免疫性肝炎患者。

1.2 儀器與試劑 CFX96實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀、電泳儀、凝膠成像儀均購于美國Bio－Rad 公司；ABI3130／3130XL DNA 測序儀購于美國ABI公司；HBV YMDD 基因突變診斷試劑購于上海克隆生物高技術有限公司；HBV 基因分型和變異位點檢測試劑購于北京鑫諾美迪有限公司；探針引物、TaqDNA聚合酶、DNA提取液、DNA濃縮液、DNA去離子水等均使用北京鑫諾美迪有限公司提供的試劑盒內的原裝試劑。

1.3 方法1200例乙型肝炎患者均行乙型肝炎5項、乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV－DNA）、乙型肝炎病毒A、B、C、D分型、YMDD 基因突變位點等檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測乙型肝炎5項，PCR 定量HBV－DNA，線性探針反向雜交法進行HBV 基因分型，各項檢測均完全按照相應試劑盒說明書嚴格執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV－DNA 病毒定量檢測對1200例確診為乙型肝炎的患者進行PCR 檢測，577份HBeAg 血清學轉陰標本中，HBV－DNA≥103copy／mL標本共計233例，占40.38%；HBV－DNA＜103copy／mL標本共計344份，占59.62%。623份HBeAg血清學未轉陰標本中，HBV－DNA≥103copy／mL的標本共計508例，占81.54%；HBV－DNA＜103copy／mL 標本共計115份，占18.46%。

2.2 HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉陰患者和未轉陰患者的基因型分布檢測對233例HBV－DNA≥103copy／mL的HBeAg血清學轉陰患者標本進行乙型肝炎病毒基因型檢測，分型結果顯示A、B、C、D 基因型所占比例依次為69.96%（163／233）、24.46%（57／233）、4.72%（11／233）、0.86%（2／233）；對未發(fā)生HBeAg血清學轉陰，且HBV－DNA≥103copy／mL的508例患者基因分型檢測，A、B、C、D 基因型所占比例依次為57.48%（292／508）、36.22%（184／508）、5.71%（29／508）、0.59%（3／508）。HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉陰患者和未轉陰患者在A、B、C、D 基因型分布上比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉陰患者和未轉陰患者的YMDD 突變率檢測對HBV－DNA≥103copy／mL 的HBeAg血清學轉陰患者233例和未轉陰的508例患者的病歷資料進行分析發(fā)現(xiàn)，所有患者均有拉米夫定6個月以上的服用史。YMDD 基因變異檢測共發(fā)現(xiàn)YMDD 變異133例，其中HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg 血清轉陰患者106例，占HBV－DNA陽性且血清學轉陰患者的45.49%（106／233）；HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg血清未轉陰患者27例，占DNA 陽性且血清學未轉陰患者的5.31%（27／508），兩組基因突變率比較，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 HBeAg血清學轉陰與未轉陰患者的YMDD 突變情況

2.4 HBeAg血清學轉陰與YMDD 突變、HBV 基因型之間的相關性分析乙型肝炎患者的YMDD 突變型多為B型和C型，明顯高于A型和D型，突變位點多為V 突變。見表2。

表2 HBeAg血清學轉陰與YMDD 突變、HBV 基因型的相關性（n）

3 討論

長期以來人們普遍認為“小三陽”比“大三陽”輕，甚至更有人認為“小三陽”無需治療。然而，越來越多的研究表明這種觀點是不科學的［6－7］。本研究證實不少乙型肝炎患者經拉米夫定治療一段時間后，雖然乙型肝炎病毒e抗原已轉陰，即成為“小三陽”，但其HBV－DNA 拷貝數(shù)仍然大于或等于103，即仍然有病毒復制。倘若此時沒有繼續(xù)檢測病毒復制的情況，僅以HBeAg轉陰為停藥指標，則患者病情復發(fā)迅速且復發(fā)率高，甚至出現(xiàn)病情加重或耐藥現(xiàn)象，后期治療難度較大。

抗病毒治療是慢性HBV 感染的一項基本治療措施。核苷酸類似物拉米夫定作用于HBV 多聚酶活性部位YMDD 基因序列，從而抑制HBV－DNA 復制，抗病毒效果明顯［8－10］。但臨床上部分患者可表現(xiàn)為無應答或隨著用藥時間的延長，HBV 發(fā)生突變并導致對拉米夫定耐藥，影響拉米夫定的療效。本研究通過使用YMDD 診斷試劑盒，對收集的1200份乙型肝炎患者血清標本檢測基因突變位點，結果表明HBeAg血清學轉陰的患者仍然存在基因位點變異，并且這部分患者的突變率明顯高于HBeAg 血清學未轉陰的患者。因此，筆者分析HBeAg血清學轉陰，可能只是因為YMDD 位點發(fā)生了突變，實際上其病毒仍然處于不斷復制中。楊彥麟等［11］對HBeAg陽性患者中HBV 基因型分布及YMDD 變異位點的分析，顯示HBeAg陽性患者的基因型突變率達到35.34%，但筆者的研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性患者的基因型也會發(fā)生突變，并且突變率高達45.49%。因此，對HBeAg陰性患者不能放松警惕，應持續(xù)或定期監(jiān)測HBV－DNA 拷貝數(shù)。

本研究結果顯示，乙型肝炎患者的YMDD 突變型多為B型和C型，明顯高于A型和D型，突變位點多為V型，這與相關研究結果一致［11］。說明長期服用拉米夫定易使患者發(fā)生YMDD 突變，尤其是B型和C型的突變，從而出現(xiàn)HBV 對拉米夫定耐藥，進而在臨床檢查上出現(xiàn)HBeAg陰性，但乙型肝炎病毒拷貝數(shù)仍走高的情況，不利于患者后期的抗病毒治療。本研究提示HBeAg血清學轉陰、HBV 基因型、YMDD 基因突變3者具有一定的關聯(lián)，在臨床抗病毒治療上不能只考慮其中1個因素，而應該綜合考慮以上因素，優(yōu)化乙型肝炎抗病毒治療方案，達到最佳效果。

綜上所述，乙型肝炎患者的HBeAg血清學轉陰、HBV 基因型、YMDD 基因突變3者具有一定的關聯(lián)，應予以密切關注。

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