核酸檢測技術在獻血人員血液篩查中的應用

柯苑，趙靜，馬成平，黃敏，姚慧蘭，張立波，馬貴明（南京紅十字血液中心實驗室，南京 210003）

血液篩查是確保血液及血液制品安全的重要措施之一，根據國內現行法律法規的要求，目前使用的酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測的是抗原抗體，但由于感染“窗口期”較長及病毒變異，隱匿性感染等因素的存在，使得臨床輸血存在一定的風險。核酸檢測（NAT）技術可直接檢測病毒核酸，縮短檢測方法的“窗口期”，降低輸血感染的風險，已成為發達國家血液篩查病毒的重要手段［1］。目前可用于血液篩查的NAT 技術主要有多聚酶鏈反應（PCR）和轉錄介導擴增技術（TMA）。本中心于2013年3月正式采用TMA 法核酸檢測工作，建立并完善了血液核酸檢測相關體系文件，形成了系統的檢測流程。2013年3～10月共檢測了54358份獻血者血液標本，檢測效果較好。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本2013年3～10月本中心檢測的54358份獻血者血標本。

1.2 儀器與試劑諾華公司Procleix TIGRIS System 檢測系統以及Ultrio HIV－1／HCV／HBV 檢測試劑和鑒別試劑，批號為614952。

1.3 方法采集靜脈血5mL于分離膠抗凝試管中，采集后6 h內3000r／min離心15min，放入2～8℃冰箱內儲存，48h內送實驗室完成標本抽提、擴增和檢測工作。測試包括3個主要步驟：（1）通過特異性目標捕獲將病毒核酸從標本中分離；（2）通過TMA 方法實現目標核酸片斷的擴增；（3）雜交保護方法檢測擴增產物。Procleix TIGRIS System 檢測系統聯檢試劑檢測到陽性標本后，可通過人類免疫缺陷病毒1型（HIV－1）鑒別試劑、丙型肝炎病毒（HCV）鑒別試劑、乙型肝炎病毒（HBV）鑒別試劑進行鑒別檢測，以分辨引起反應的病毒。鑒別試驗步驟與聯檢相同，聯檢陽性標本放于－20℃冰箱，1周進行1次鑒別試驗。

2 結果

2.1 所有標本檢測結果54358份標本HBV／HCV／HIV－1聯檢初篩結果顯示226份陽性，NAT 陽性ELISA 陰性標本共51份。聯檢初篩陽性標本再進行鑒別試驗，結果顯示HBVDNA、HIV－1RNA、HCV－DNA陽性例數分別為32例（0.059%）、1例（0.002%）、0例。NAT 陽性ELISA 陰性標本共51份，諾華鑒別試劑鑒別率為50%～60%，因此有鑒別結果的標本只有33份。

2.2 HIV－1RNA陽性患者檢測過程顯示為HIV－1RNA陽性的1份標本，獻血者于2013年5月12日獻全血400mL，5月13日實驗室ELISA 方法檢測此標本HIV 抗體／抗原＋抗體結果均為陰性，核酸檢測HIV－1RNA 結果為陽性。5月20日重新抽取該名獻血者全血標本，核酸檢查仍為陽性，ELISA為弱陽性。該份獻血者標本經南京市疾控中心HIV 確證實驗室免疫印跡法（WB）確認為HIV－1疑似陽性。11月27日，再次抽取該名獻血者血標本送市疾控中心經WB法確認為HIV－1陽性。見表1。

表1 HIV－1RNA 陽性ELISA 陰性標本初篩及隨訪結果

3 討論

常規酶聯免疫檢測法可檢測血液中的抗原和抗體，但當獻血者在感染“窗口期”或隱匿性感染時獻血，受血者將面臨輸血后感染HIV 或肝炎病毒的風險。有文獻表明，美國90%以上輸血傳播HIV 和HBV 感染以及75%以上輸血傳播HCV 感染均來自“窗口期”患者血液［2－3］。我國屬于肝炎的高發區，人群中HBsAg攜帶率為9.09%，HBV 流行率大于60%［4］。我國目前篩查獻血者是否感染HBV 的指標仍為HBsAg，因此不能消除HBV 感染“窗口期”以及隱匿性感染造成的漏檢。本研究54358份獻血者標本中檢出32例ELISA 陰性HBVDNA 陽性標本，陽性率比深圳地區報道的131174份血清學陰性標本檢出22份HBV－DNA 陽性標本結果略高［5］。沒有檢出HCV 陽性而ELISA 陰性的獻血者，與國內青島、江西等地區相關報道相似［6－7］。ELISA檢測陰性，但實際HIV－1RNA為陽性的獻血者檢出1例，通過回訪了解到該例患者是1例典型的處于HIV 感染“窗口期”的案例，目前使用的HIV酶免檢測試劑為第3代和第4代組合，第4代試劑的“窗口期”比第三代雖然縮短了1周左右但還是大于NAT 的“窗口期”。如果只用ELISA 法將會造成漏檢，該獻血者所獻的400mL全血將按常規制備成懸浮紅細胞，血漿和冷沉淀等3種血液制品用于臨床，有可能輸給3名患者造成輸血后HIV 病毒感染。根據國內疾病預防控制中心報道，2013年1月新增HIV 感染者／AIDS患者7365例，其中輸血及使用血制品傳播37例［8］。

與ELISA 法相比，NAT 法具有更高的敏感度和特異性，通過縮短“窗口期”可以對感染做到早期檢測，進一步減少輸血造成疾病傳播的可能性。NAT 檢測幾乎不受ELISA 檢測制約因素的影響，故兩種檢測技術存在良好的互補性。將NAT作為采血血樣的常規篩查技術，可為臨床安全用血提供有力保障。與其他NAT 檢測方法相比，目前使用的TMA 法優點主要有：（1）可以在1支試管內同時檢測多個病毒，檢測前不需要混樣，簡化了檢測過程；（2）減少血液篩查步驟和縮短處理時間，省去了陽性標本進一步拆分的過程，從而更快得到結果。但是NAT 也不能完全取代ELISA 檢測，首先NAT 篩查血液所需試劑成本昂貴，對檢測環境、基礎設施等要求較高。其次NAT 篩查血液并不能完全杜絕輸血傳染病的風險，其檢測效果取決于檢測系統的有效運轉和檢測靈敏度。研究表明，低病毒載量的感染標本容易在NAT 篩查時被漏檢，因此對NAT試劑的靈敏度提出了更高的要求。NAT 操作步驟較復雜，在人員培訓、管理模式上都與酶免檢測存在較大區別，對操作人員的技能要求較高，需要嚴格的防污染措施以避免標本間交叉污染和擴增產物污染，同時需對整個檢測流程進行質量控制。

綜上所述，獻血相關法律法規標準尚未涉及血液篩查假陽性獻血者獻血資格的保留問題，因此上級管理部門也應該在NAT 全面應用于血液篩查之前，以保障血液安全為大前提，對單獨NAT 陽性獻血者告知以及獻血資格是否保留等問題做出明確規定，作為廣大采供血機構執行的依據。

［1］Engelfriet CP，Reesink HW.Implementation of donor screening for infectious agents transmitted by blood by nucleic acid technology（International Forum）［J］.Vox Sanguinis，2002，82（1）：87－111.

［2］文國新，美黑麗.血液感染性安全問題的現狀與展望［J］.中國輸血雜志，2006，19（4）：332－334.

［3］曾勁峰，楊寶成.血液篩查核酸檢測的建立及應用［J］.中國輸血雜志，2008，21（11）：827－828.

［4］梁曉峰，陳園生，王曉軍.中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學研究［J］.中華流行病學雜志，2005，26（9）：655－658.

［5］葉賢林，李活，許曉絢，等.核酸擴增技術在獻血者血液HBV－DNA、HCV－RNA 及HIV－1RNA 篩查中的應用研究［J］.中國輸血雜志，2010，23（1）：6－10.

［6］吳玉清，楊忠思，趙林，等.青島地區無償獻血者血液病毒核酸檢測的研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（11）：834－836.

［7］苗燕平，何華慶，后平欽，等.NAT 檢測在血液篩查中的應用［J］.實驗與檢驗醫學，2010，28（3）：325－326.

［8］中國疾病預防控制中心，性病艾滋病預防控制中心.2013年1月全國艾滋病性病疫情及主要防治工作進展［J］.中國艾滋病性病，2013，19（3）：159－160.