合歡皮總皂苷提取工藝優化

王巧文，錢澤秀，孫紅祥

(浙江大學動物科學學院，杭州310058)

合歡皮(Cortex Albizziae)為豆科植物合歡(Albizziajulibrissin Durazz.)的干燥莖皮，其味甘、性平，具安神解郁、活血消腫功，主治心神不安、躁動不安、跌打損傷和愴惶療毒等癥［1］。合歡皮含有三萜皂苷、生物堿、黃酮類、木脂素、多糖等多類化學成分，其中三萜皂苷是合歡皮的主要有效成分，具有廣泛的生理活性和藥理作用，如抗抑郁、抗生育、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、保肝、抗血管生成、抗腫瘤、抗菌和免疫調節等［2-4］。近年來，研究發現合歡皮總皂苷對禽流感–新城疫重組二聯活疫苗［5-6］、豬偽狂犬病弱毒疫苗［7］、豬 O 型口蹄疫滅活疫苗［8］等商品疫苗均具有顯著的佐劑作用，并在靶動物上得到了證實。為了建立科學、合理的提取工藝，進一步促進合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開發，試驗根據合歡皮中皂苷的理化性質，建立了以齊墩果酸為對照品，分光光度法測定含量的方法，并采用單因素試驗和正交設計方法，以總皂苷收率為指標，對醇提工藝乙醇濃度、乙醇用量、提取時間和提取次數進行考察，優選合歡皮總皂苷的提取工藝。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 TU-1800PC型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);Sartorious 1700型電子天平(W-Germany);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);W501型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);R502B型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司);SHB-Ш循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DLSB低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 試劑 合歡皮絲，浙江省景岳堂藥業有限公司，批號:13073103;齊墩果酸對照品，中國食品藥品檢定研究院 (110709-200304);試驗用水為超純水;所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總皂苷含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品11.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取10 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得濃度為0.044 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶中，按實驗設置的處理條件提取。提取液濾過，合并濾液，減壓回收乙醇、以超純水調整體積至50 mL。取20 mL經等體積乙醚萃取3次脫脂后，以等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑、濃縮至干，加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，精密吸取0.5 mL于10 mL容量瓶并定容，混勻，即得樣品溶液。

2.1.3 檢測波長選擇 精密吸取對照品溶液2.0 mL和樣品溶液0.5 mL，分別置于10 mL刻度螺紋試管中，70℃恒溫水浴加熱蒸干。精密加入5%香草醛–冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密封，60℃水浴反應15 min，冰浴冷卻10 min，再精密加入5 mL冰醋酸，搖勻。以空白試劑做參比，用TU-1800型紫外可見分光光度計，于400～700 nm波長范圍內掃描。結果齊墩果酸和樣品溶液均在550 nm波長處有最大吸收，故選擇550 nm為測定波長。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至10 mL 刻度試管中，按“2.1.3”項下方法操作，以空白試劑做參比，按紫外分光光度法于550 nm波長處測定吸光度［1］。以吸光度A為縱坐標、齊墩果酸濃度C(μg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:A＝0.0418C+0.0022(r＝0.9991)?？梢?，齊墩果酸在每mL含3.67～18.33 μg的濃度范圍內，其濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取樣品溶液5份，按“2.1.3”項下方法操作，于550 nm波長處測定吸光度，RSD為0.10%(n＝5)，表明該方法精密度良好。

2.1.6 樣品溶液穩定性 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項下方法處理，分別顯色后0、5、10、15、20、25、30 min，于 550 nm 波長處測定吸光度。結果吸光度基本一致，RSD為0.20%(n＝6)，說明樣品溶液顯色后30 min內基本穩定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批藥材6份，分別按“樣品溶液制備”項下方法制備樣品溶液，“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算總皂苷含量，RSD為0.92%(n＝6)，說明重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批藥材6份，加入不同量的齊墩果酸標準品，按“樣品溶液制備”項下制備樣品溶液，“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算加樣回收率。結果平均回收率為100.33，RSD為1.50%(n＝6)。可見，本方法能準確地測定合歡皮總皂苷含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間2 h、提取次數3次、提取溶劑用量12倍的條件下，分別用質量濃度50%、60%、70%和80%乙醇進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖1。隨著乙醇濃度的增加，合歡皮總皂苷收率呈先增大后減小。因此，選擇60%、70%、80%作為正交試驗中乙醇濃度的3個水平。

2.2.2 乙醇用量考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間2 h、提取次數3次、乙醇濃度70%的條件下，分別以藥材量的6、8、10和12倍的乙醇進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖2。隨著乙醇用量倍數的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢。因此，選擇10、12、14倍作為正交試驗中乙醇用量的3個水平。

圖1 乙醇濃度對總皂苷收率的影響

圖2 乙醇用量對總皂苷收率的影響

2.2.3 提取時間考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定提取次數為3次、乙醇濃度70%、乙醇用量12倍的條件下，按每次提取時間分別為1、1.5、2、2.5 h 進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖3。2 h以內隨著提取時間的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢，然而再延長提取時間差異不顯著。因此，選擇1、1.5和2 h作為正交試驗中提取時間的3個水平。

2.2.4 提取次數考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間為2 h、乙醇濃度70%、用量12倍的條件下，分別提取1次、2次、3次和4次。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖4，提取2次總皂苷收率顯著高于1次，而2次、3次和4次之間總皂苷收率差異不顯著?？紤]到提取次數增多增加能耗，且2次基本提盡總皂苷。因此，在正交試驗中固定提取次數為2次。

圖3 提取時間對總皂苷收率的影響

圖4 提取次數對總皂苷收率的影響

2.3 正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇影響合歡皮總皂苷收率因素中有統計學意義的水平做正交試驗，采用 L9(34)正交試驗表考察最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

由表2極差R的數據分析可知:各因素的影響程度依次為B＞C＞A，即乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量。方差分析結果表明:B因素(乙醇濃度)對總皂苷收率有顯著的影響(P＜0.01)，而A(乙醇用量)和C(提取時間)因素無顯著性影響(P＞0.05)，以A3B2C3組合為佳，即乙醇用量14倍、乙醇濃度70%和提取時間2 h。

2.4 驗證試驗 取同一批藥材，按上述確定最佳組合A3B2C3進行驗證試驗，結果見表4。A3B2C3工藝提取的總皂苷平均收率為8.617 mg·g-1，RSD＝0.115%(n＝3)。驗證試驗合歡皮總皂苷收率高于正交試驗中各次的結果，說明該提取工藝合理、穩定、可行。

表4 驗證試驗結果

3 討論

合歡皮中皂苷化合物種類多，化學結構復雜。目前分離得到的40多個化合物多為齊墩果烷型苷元與8～9個單糖分子以及二分子單萜烯酸(辛二烯酸衍生物)結合而成的一系列分子量在2000左右的三萜皂苷，包括單糖鏈、雙糖鏈和三糖鏈［4］。目前文獻報道的合歡皮總皂苷含量測定方法包括紫外分光光度法［9］和 HPLC法［10］。由于合歡皮中皂苷化合物的化學結構具有極大的相似性，分離純化十分困難，目前尚無法定的合歡皮皂苷標準品。鑒于合歡皮中皂苷多為齊墩果烷型皂苷，上述二種定量方法均選用齊墩果酸為對照品。HPLC法需先通過酸水解將皂苷水解成苷元，然后檢測齊墩果酸［10］。此法操作復雜繁瑣，且合歡皮皂苷有多種苷元。紫外分光光度法所需設備及操作簡單，易普及推廣，靈敏度、準確度、重復性較高，應用范圍廣。因此，本文采用紫外分光光度法，對文獻方法［9］作了改進，并進行了方法學考察。證實該方法操作簡便、準確性高、穩定性強、重現性好，可行性良好。

有關合歡皮皂苷制備工藝，施建軍等［10］曾以干粉得率、總苷含量、對人微血管內皮細胞的IC50值為指標，選取乙醇濃度、回流時間、提取次數、萃取次數四種因素，采用正交試驗法優化了乙醇回流–水飽和正丁醇萃取工藝路線，得到了最優提取路線為用70%的乙醇，提取2次，每次回流3 h，最后用正丁醇萃取4次。該工藝使用的正丁醇沸點高，回收困難，不利于大生產。實驗室前期篩選得到的具有佐劑活性的合歡皮總皂苷采用適于工業化大生產的乙醇回流–大孔樹脂洗脫工藝路線制備。試驗選擇對合歡皮皂苷提取影響較大的乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數四個關鍵因素進行單因素試驗，確定正交試驗的因素和水平設置。在此基礎上，通過正交試驗法優選合歡皮總皂苷的最佳提取工藝條件，即乙醇用量14倍、濃度乙醇70%、提取2次、每次2 h，得到的合歡皮總皂苷收率為 8.617 mg·g-1。

該提取工藝操作簡單、穩定、可行，為合歡皮總皂苷后續的純化、以及合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開發奠定了基礎。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典 二○一○年版［S］.

［2］侯永坤，番雨利，冷艷華.合歡屬植物中三萜皂苷及藥理活性研究進展［J］.中國醫藥導報，2010，7(29):7-8.

［3］Kokila K，Priyadharshini S D，Sujatha V.Phytopharmacological properties of Albizia species:a review ［J］.Int J Pharm Pharm Sci，2013(Supp 3)，5:70-73.

［4］Han LF，Pan GX，Wang YF，et al.Rapid profiling and identification of triterpenoid saponins in crude extracts from Albizia julibrissin Durazz.by ultra high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry ［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55:996-1009.

［5］何樹旺.合歡皮皂苷佐劑活性的研究［D］.杭州:浙江大學，2009.

［6］李富強.合歡皮皂苷佐劑的免疫學活性研究［D］.杭州:浙江大學，2010.

［7］施明華.合歡皮皂苷佐劑活性部位對兩種獸用疫苗的佐劑作用［D］.杭州:浙江大學，2012.

［8］張 娟.合歡皮皂苷對豬O型口蹄疫滅活疫苗的佐劑作用［D］.杭州:浙江大學，2014.

［9］馮 磊，陳 爽，邱麗穎，等.紫外分光光度法測定合歡皮總皂苷的含量［J］.華西藥學雜志，2009，24(6):642-644.

［10］施建軍，譚 瑩，杜 斌，等.HPLC法測定合歡皮抗新生血管有效部位中的總皂苷［J］.中成藥，2012，34(10):2025-2028.

［11］施建軍.合歡皮總皂苷提取工藝路線的優化和質量標準的初定［D］.無錫:江南大學，2012.