HPLC法測(cè)定復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量

陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽(yáng)550003)

《中華人民共和國(guó)獸藥典》中復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片［1］中磺胺對(duì)甲氧嘧啶(C11H12N4O3)的含量測(cè)定采用的是永停滴定法，但是在應(yīng)用實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定性較差，主要原因可能是制劑中的輔料干擾了電極的敏感性，不能有效控制獸藥復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的質(zhì)量。本研究建立了復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法，并根據(jù)“獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”對(duì)新建立方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、精密度、專屬性、耐用性及線性等進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器);BP211D型電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司);超聲波清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器廠);磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉對(duì)照品(Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批號(hào):10228，含量:99.0%);試驗(yàn)樣品復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片由某動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)為:201121001、20121101、20121201);磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料(某獸藥原料有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20130206);乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm);柱溫為40℃;流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 270 nm［2］;進(jìn)樣體積為 10 μL。在此色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 磺胺對(duì)甲氧嘧啶色譜圖

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉對(duì)照品約54 mg(含磺胺對(duì)甲氧嘧啶約50 mg)，置50 mL量瓶中，加鹽酸10 mL，超聲處理5～10 min。取出，加水稀釋至刻度，混勻，即得濃度為1.0 mg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液5 mL，置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得50 μg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片20片，精密稱定，研細(xì)。精密稱取適量(約相當(dāng)于磺胺對(duì)甲氧嘧啶0.2 g)置200 mL量瓶中，加鹽酸10 mL，超聲處理 5～10 min。取出，加水50 mL，再超聲處理5～10 min。取出，加水稀釋至刻度，過(guò)濾。精密量取5 mL濾液置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍 精密量取1.0 mg/mL的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)照品貯備液 0.5、1、2、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，得含磺胺對(duì)甲氧嘧啶濃度分別為 5.0、10、20、50、100 μg/mL的對(duì)照溶液系列。精密吸取各對(duì)照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。磺胺對(duì)甲氧嘧啶濃度在5.0～100 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Area＝33.56×Amt-12.15，相關(guān)系數(shù)大于0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 磺胺對(duì)甲氧嘧啶溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度 取企業(yè)提供的3批復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片樣品各20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于磺胺對(duì)甲氧嘧啶0.2 g);另精密稱取批號(hào)為20130206的磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥粉約0.25 g。樣品和原料藥均按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行制備成供試品溶液，每個(gè)批號(hào)作三個(gè)平行，每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，進(jìn)行含量測(cè)定，以Zorbax SB C18為固定相，采用50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行單點(diǎn)定量(除非特別說(shuō)明，均以Zorbax SB C18為固定相，并用50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行單點(diǎn)定量計(jì)算，下同)。以測(cè)定結(jié)果百分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗(yàn)的精密度，精密度RSD分別為0.06、0.02、0.02和0.50，表明方法的精密度良好。結(jié)果見表1。

2.3 準(zhǔn)確度 精密稱取2.2中研細(xì)的批號(hào)為20121001復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片粉末適量，按高(H)、中(M)、低(L)三個(gè)濃度水平分別添加磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥粉(已知磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量為89.50%)，制得向已知含量制劑中添加已知測(cè)定物的添加樣品，每個(gè)濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。按1.2.3項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。以磺胺對(duì)甲氧嘧啶的實(shí)際測(cè)定含量和理論含量(制劑中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值計(jì)算磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，三個(gè)不同添加水平的磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率均在97.9% ～100.6%之間，方法具有良好的回收率。

表1 精密度及含量測(cè)量結(jié)果

表2 準(zhǔn)確度測(cè)量結(jié)果

2.4 耐用性 取按準(zhǔn)確度測(cè)定項(xiàng)下制得的樣品，保持流動(dòng)相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色譜儀上分別使用Waters PHA C18(5 μm，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱，于40 ℃及15 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明測(cè)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明耐用性良好。

2.5 專屬性 在樣品測(cè)試色譜圖中，標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間附近未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，可見方法的專屬性良好。

2.6 含量測(cè)定 方法同2.2精密度項(xiàng)，測(cè)量結(jié)果見表1。結(jié)果表明，批號(hào)為 20121001、20121101、20121201的三批企業(yè)樣品的磺胺對(duì)甲氧嘧啶平均含量分別為53.01%、52.03%和53.06%，磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥粉中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的平均含量為89.50%。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化。參考復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉粉的含量測(cè)定、磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法及磺胺對(duì)甲氧嘧啶殘留的檢測(cè)方法可知，以前測(cè)量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動(dòng)相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)［1］、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)［3］、0.017 mol/L 磷酸 - 乙腈(80+20)［4］、磷酸鹽溶液 - 甲醇(65+35)［5］等。采用流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)時(shí)，磺胺對(duì)甲氧嘧啶的出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形良好，且0.1%的磷酸溶液也容易配制。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化。在進(jìn)行樣品處理的過(guò)程中，分別采用10 mL鹽酸、稀鹽酸、0.4%的NaOH溶液溶解后，超聲處理5～10 min，然后再加水定容。發(fā)現(xiàn)采用10 mL鹽酸溶解后超聲處理5～10 min，然后加入50 mL水再超聲處理5～10 min，可以有效降低復(fù)方制劑中的輔料對(duì)磺胺對(duì)甲氧嘧啶的吸附，從而提高磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率。

3.3 由于條件所限，在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)因無(wú)法得到復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片制劑的所有原料，故采用制劑添加磺胺對(duì)甲氧嘧啶原料藥粉的方法驗(yàn)證準(zhǔn)確度，同時(shí)，采用實(shí)測(cè)含量與理論含量進(jìn)行比較的方法確定磺胺對(duì)甲氧嘧啶的回收率，這樣可以消除制劑中原有的磺胺對(duì)甲氧嘧啶對(duì)低水平添加回收率計(jì)算的影響。

3.4 高效液相色譜法還可以同時(shí)測(cè)定復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中的甲氧芐啶，樣品色譜圖中保留時(shí)間約為4.2 min處的色譜峰即為甲氧芐啶，因篇幅所限，在此不再贅述。同時(shí)，樣品色譜圖中保留時(shí)間約為2.6 min處還有一個(gè)不明色譜峰，表明樣品中還含有其他不明物質(zhì)。

3.5 保持流動(dòng)相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色譜儀上分別使用Waters PHA C18(5 μm ，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm ，4.6×250 mm)色譜柱于40℃及15℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，磺胺對(duì)甲氧嘧啶的保留時(shí)間有變化，但對(duì)測(cè)量結(jié)果無(wú)影響。

3.6 建立的復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測(cè)定法是可行的，各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)均比較理想，可以作為復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。新方法采用高效液相色譜法測(cè)量復(fù)方磺胺對(duì)甲氧嘧啶片中磺胺對(duì)甲氧嘧啶含量的同時(shí)，還可以根據(jù)供試品溶液與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間是否一致對(duì)磺胺對(duì)甲氧嘧啶進(jìn)行鑒別;現(xiàn)有方法采用永停滴定法測(cè)量磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量，雖然，永停滴定法使用的儀器設(shè)備比較簡(jiǎn)單，容易操作，維護(hù)成本比液相色譜儀低。但需要作硫酸銅沉淀反應(yīng)鑒別其真?zhèn)危僮鞒绦蛏燥@繁瑣，同時(shí)，永停滴定法的專屬性也不如液相法佳。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)［M］.二○一○年版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.

［2］查玉兵，陳 美，王曉芳，等。高效液相色譜法測(cè)定豬肉中五種磺胺類藥物殘留量［J］.分析儀器，2008，(4):44-45.

［3］中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸藥殘留檢驗(yàn)操作規(guī)程CJCZ020［Z］.

［4］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.農(nóng)牧發(fā)［2001］38號(hào)文件［S］.

［5］耿士偉，曲 斌，姜加華，等.QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測(cè)定雞肝中七種磺胺類藥物殘留［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45(10):16-19.