超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉、豬肝及豬尿中的阿托品殘留

胡興娟，吳寧鵬 ，孟 蕾，彭 麗，李慧素，班付國

(1.鄭州大學，鄭州450001;2.河南省獸藥監察所，鄭州450008)

阿托品(atropine)是從茄科植物顛茄、曼陀羅及莨菪中分離提取的一種M膽堿受體阻斷藥，具有解除平滑肌的痙攣、抑制腺體分泌、解除迷走神經對心臟的抑制、興奮呼吸中樞等藥理活性，在獸醫臨床上主要作為解毒藥，緩解有機磷中毒的癥狀。但近年來，在生豬的屠宰環節，不法商販利用阿托品的另外的一些藥理特點，在豬宰殺前非法注射阿托品，以保水增重，提高宰殺率，從而獲得非法高額利潤。若食用含有阿托品殘留的動物性食品中后，人會出現瞳孔擴大、神志模糊、狂躁不安、抽搐、昏迷等癥狀，因食用含有阿托品的豬肉而產生的人群集體中毒的事件也時有報道。因此，為保障畜產品質量安全，維護人體健康，建立豬組織及豬尿中阿托品殘留的測定方法是非常必要的。

目前，國內外阿托品含量的測定通常采用高效液相色譜(HPLC)［1-2］和液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)［3-4］，并且主要集中在人體血液、尿液、藥物和藥用植物中阿托品的測定，豬組織和豬尿中阿托品的測定方法還未見報道。因此，本研究以超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)為檢測手段，建立了豬肉、豬肝及豬尿中阿托品的分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司，型號為 TQS);XP205分析天平(瑞士MettlerToledo公司)，SIGMA 3-30K離心機(德國Sigma公司);KQ-3200E超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司);N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation);MS3 basic渦旋混合器(IKA);Agela Technologies Cleanert?PEP-2固相萃取柱(3CC/60mg)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸為色譜純;阿托品標準品含量為96.5%，購于中國藥品生物制品檢定所;實驗用水為經Milli-Q凈化系統制備的去離子水。

1.3 標準溶液的配制 準確稱取標準品約10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;配制成1 mg/mL的標準儲備液。-20℃下保存，有效期為三個月。準確移取標準儲備液適量，用甲醇-0.1%甲酸水(V/V，20∶80)稀釋成一定濃度的標準工作液。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈溶液;流速:0.3 mL/min;柱溫:40℃;進樣量:2 μL;梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質譜參考條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應監測;毛細管電壓:2.5 kV;源溫:150℃;脫溶劑溫度:500℃;錐孔氣流速為150 L/h，脫溶劑氣流速為1000 L/h;定性離子對、定量離子對及對應的碰撞能量參考值見表2。

表2 阿托品保留時間及定性、定量離子對

1.4.3 樣品前處理 稱取豬組織(豬肉、豬肝)2 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)提取液，渦旋 30 s，振蕩 10 min。4000 r/min離心5 min，取上清液。向殘渣中加入10 mL乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)溶液進行重復提取一次，合并兩次提取液。于50℃下氮吹濃縮至約2 mL，加入8 mL水，混勻。加入5 mL正己烷，震蕩5 min。8000 r/min離心5 min，取下清液，再加入5 mL正己烷，重復除脂，取下清液，備用。PEP-2固相萃取柱依次用甲醇和水各3 mL活化，將備用液全部過柱后，分別用3 mL水和3 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干。3 mL乙腈洗脫，洗脫液于50℃下氮氣吹干。準確加入甲醇 -0.1%甲酸水(V/V，20∶80)溶液1.0 mL溶解定容，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，進液相色譜-串聯質譜儀測定。

量取豬尿2 mL于50 mL離心管中，加入8 mL水，PEP-2柱凈化，凈化步驟同豬組織。

2 結果

2.1 線性關系 稱取空白樣品，按照1.4.3處理，

在氮氣吹干前，準確移取阿托品標準溶液適量，加入洗脫液中，制得0.2、0.5、1、2、5、10 μg/kg 濃度的基質匹配標準溶液，阿托品在相關濃度范圍內呈良好線性關系，回歸方程及相關系數見表3。

2.2 檢測限和定量限 檢測限:添加一定量的阿托品標準溶液于2 g空白樣品中，經過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥3時，測得阿托品的檢測限為0.2 μg/kg。定量限:添加一定量的阿托品標準溶液于2 g空白樣品中，經過提取凈化并測定，藥物的信噪比S/N≥10時，測得阿托品的定量限為0.5 μg/kg。

表3 阿托品的回歸方程及相關系數

2.3 方法精密度與準確度 在空白樣品中分別添加0.5、1、2.5 μg/kg三個濃度的阿托品標準溶液，每個濃度做5個平行，連續做3批，其平均回收率、變異系數如表4所示。可以看出阿托品在豬肉、豬肝及豬尿中的批間平均回收率為78.3%～98.2%，批內變異系數在1.8% ～14.1%之間，批間變異系數在4.3%～11.2%之間。

豬肉空白基質標準溶液、豬肉空白溶液、豬肉空白添加樣品提取離子質量色譜圖見圖1-圖3。

3 討論與小結

3.1 質譜條件優化 實驗采用0.2 mg/L阿托品的標準溶液在電噴霧離子源正離子模式下，采用流動注射泵連續進樣方式進行全掃描，確定母離子為［M+H］+，其質荷比m/z為290.1。對母離子進行子離子全掃描，得到豐度較高的兩個子離子m/z 124.1和m/z 93.0，其中m/z 124.1是母離子失去托品酸(C9H10O3)產生的，該離子失去NH2CH3得到子離子m/z 93.0，在多反應監測模式下對其質譜條件進行優化。最后選取豐度較強的子離子m/z 124.1作為定量離子，豐度次之的子離子m/z 93.0為定性離子。

3.2 提取液優化 提取阿托品時一般使用乙腈［3］、乙酸乙酯［5］或者乙腈和一定比例的0.1%甲酸水溶液［6］作為提取液。本研究比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)對阿托品的提取效率，結果發現，乙酸乙酯和甲醇提取的雜質較多，且回收率較低;乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)比乙腈的提取效率高，基質效應較弱。最終選取乙腈-0.1%甲酸水(V/V，90∶10)作為提取液。

圖2 豬肉空白溶液提取離子質量色譜圖

圖3 豬肉空白添加阿托品提取離子質量色譜圖(1μg/kg)

3.3 凈化條件優化 已報道的凈化方法主要是固相萃取法，使用的固相萃取柱主要是 MCX柱［7］。本研究分別考察了MCX、PEP-2和C18固相萃取柱的凈化效果，結果表明MCX柱的凈化效果最好，但是回收率不穩定，可能是因為阿托品在堿性條件下易水解，而MCX柱在洗脫時使用了氨水，致使阿托品分解所致。PEP-2和C18柱的回收率較高，但是C18柱在處理過程容易造成柱床干涸而影響結果的平行性，因此最終選擇PEP-2小柱進行固相萃取凈化。本研究還對洗脫液和淋洗液進行了考察，分別用乙腈和甲醇洗脫待測物，結果表明，乙腈洗脫時阿托品的回收率最高，因此選擇乙腈作為洗脫液;分別用3 mL水、5%甲醇水、10%甲醇水、15%甲醇水和20%甲醇水進行淋洗，結果顯示，10%甲醇水淋洗液中即含有少量的阿托品，為更好的除去水溶性和部分脂溶性雜質，最后選擇3 mL水和3 mL 5%甲醇水作為淋洗液。

3.4 基質效應 液相色譜-串聯質譜中的產生基質效應的原因是基質中的非揮發性組分與待測物質在霧滴表面離子化的過程中產生競爭，從而影響電噴霧接口的離子化效率［8］，包括基質增強和基質抑制。本研究以豬肉、豬肝、豬尿為基質空白，比較研究了各種基質對阿托品的影響情況。結果表明，各個樣品基質對阿托品的離子化都有較強的抑制效應，抑制率在32.0% ～60.0%之間。因此，本方法選擇以基質匹配標準曲線對樣品進行分析，消除基質效應對樣品定量的影響。

3.5 小結 本研究首次建立了以UPLC-MS/MS為檢測手段測定豬組織和豬尿中阿托品的的分析方法，該方法具有靈敏、準確等特點，適用于豬肉、豬肝和豬尿中阿托品殘留的測定。

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