兩株高致病性PRRSV湖北分離株ORF5與Nsp2基因序列分析

楊 雷，馬慧慧，饒清宜，漆世華，溫文生，李玉萍，謝紅玲

（武漢中博生物股份有限公司，武漢430070）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病［1］。其主要癥狀表現(xiàn)為妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，以及各種年齡豬（特別是仔豬）的呼吸道癥狀。PRRSV屬于動脈炎病毒科，為一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約 15 kb，含有 9個開放閱讀框（ORFs）：ORF1a，ORF1b，ORFs2-7［2-3］。 PRRSV 有兩種基因型，分別為北美基因型VR-2332和歐洲基因型Lelystad 病毒（LV）［4］。 1996 年郭寶清等［5］首次從國內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。2006年我國豬群暴發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由高度變異的PRRSV引起的豬的烈性傳染病，已發(fā)病超過200萬頭豬，大約有400000頭的死亡病例［6］。本研究從發(fā)病豬場采集病料，分離得到兩株高致病性PRRSV毒株，并對其ORF5和Nsp2序列進(jìn)行分析，為研究流行毒株的變異情況及選擇合理的毒株制備疫苗進(jìn)行免疫，以及預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料和細(xì)胞 病料：采自湖北某規(guī)模化豬場疑似PRRSV感染豬的肺臟和淋巴結(jié)。細(xì)胞：Marc-145細(xì)胞來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由本公司實驗室以常規(guī)方法培養(yǎng)、保存，外源檢測純凈。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自山東勁牛公司；RNA提取試劑盒、一步法 RT-PCR 試劑盒（Code：DRR064A）、DL8000、DNA膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV美洲型毒株比對結(jié)果，分別設(shè)計了用于擴(kuò)增ORF5和Nsp2基因的引物。其中ORF5上下游引物序列為：ORF5-1：5’ -ATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’，ORF5-2：5’-CTAGAGACGACCCCATAGTTC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為603 bp；Nsp2上下游引物序列為：Nsp2-1：5’-TAGGAAGGTCAGGTCCGATT-3’，Nsp2-2：5’-ACAGGGAGCTGCTTGATGAT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為425 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4 病毒分離 取1 g疑似PRRSV病死豬組織病料，加10 mL DMEM制成組織勻漿，加青霉素、鏈霉素各2000 U／mL，反復(fù)凍融 3次，4000 r／min 離心20 min，取上清用 0.22 μm 濾膜過濾除菌，按10%的量接種至培養(yǎng)單層的Marc-145細(xì)胞，37℃吸附1 h，加10 mL維持液并于37℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況。待細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變時，收毒，置-70℃保存。同上方法連續(xù)傳代，收毒時間穩(wěn)定后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 一步法RT-PCR 按照RNA提取試劑盒說明書提取病料RNA，按照一步法RT-PCR明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下：2×一步法RT-PCR BufferⅢ 12.5 μL、上下游引物各 0.5 μL、Ex-Taq HS 0.5 μL、RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL、RAN 2 μL，加去離子水至25 μL。ORF5基因 PCR反應(yīng)程序：42℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性 10 s，1個循環(huán)；95 ℃變性 5 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。Nsp2基因PCR反應(yīng)程序同ORF5基因。反應(yīng)結(jié)束后分別取PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)電泳檢測。

1.6 序列分析 將瓊脂糖凝膠電泳含有目的片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠，按照TaKaRa公司膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段。將回收的目的片段送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果用DNA MAN軟件分析，并和GenBank中其他PRRSV毒株的Nsp2、ORF5基因序列進(jìn)行同源性比較和分析，國內(nèi)外參考序列見表1。

表1 不同來源的PRRSV毒株

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 從Marc-145細(xì)胞上成功分離到2株病毒，分別命名為HBXN和HBHS。培養(yǎng)的正常Marc-145細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清楚，界限清晰；2株分離毒株在Marc-145細(xì)胞上均可致典型CPE，主要表現(xiàn)：剛開始表現(xiàn)為細(xì)胞聚集成叢，在隨后的2～3 d內(nèi)表現(xiàn)為固縮、變圓，最后細(xì)胞開始脫落（圖1）。

圖1 正常Marc-145細(xì)胞和接毒后Marc-145細(xì)胞

2.2 一步法RT-PCR的鑒定 用設(shè)計的2對特異性引物分別進(jìn)行一步法RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約603 bp和425 bp的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。目的基因片段經(jīng)電泳回收，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與國內(nèi)外的參考序列進(jìn)行比對分析。

圖2 PCR擴(kuò)增分離毒株目的片段電泳結(jié)果

2.3 Nsp2基因序列分析 用DNA MAN軟件對PRRSV HBXN株和HBHS株的Nsp2部分基因序列進(jìn)行分析表明，兩株分離株的Nsp2基因均有2個部位出現(xiàn)了缺失，分別為3個核苷酸和連續(xù)87個核苷酸的缺失，與國內(nèi)分離株Nsp2基因序列核苷酸缺失部分的比對結(jié)果見圖3。核苷酸同源性分析表明，兩個分離株之間Nsp2基因核苷酸與氨基酸同源性達(dá)到98.8%，與國內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008的氨基酸同源性很高，介于98.5% ～99.5%；而與 NB-04、HUN4、HB-1、WUH1高致病性毒株同源性較低（表2）。遺傳進(jìn)化樹分析表明（圖4），兩個分離株的Nsp2序列與國內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008在同一亞群中，與PRRSV疫苗株pMLV和AMERVAC、NB-04株、HUN4株、HB-1株、WUH1株、LV株存在較遠(yuǎn)的遺傳距離。

2.4 ORF5基因序列分析 用DNA MAN軟件對PRRSV HBHS株和HBXN株的ORF5基因序列進(jìn)行分析表明，兩個分離株之間ORF5氨基酸同源性達(dá)到98.6%，HBHS株和 2007年國內(nèi)流行毒株HUN4的氨基酸同源性較高，為99.5%。HBXN株與HK13株的氨基酸同源性較高，為99.0%。HBHS株和HBXN株與國外分離株pMLV株、LV株和VR2332株的氨基酸同源性較低（表3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明（圖5），HBHS株和HBXN株的ORF5序列與國內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株JXA1、GD2007、GD2008、WUH1、HUN4、HK13、HB-1、NB-04的遺傳距離很近，同處一個基因群中，而與CH-1a等經(jīng)典毒株較遠(yuǎn)。

圖3 部分Nsp2基因缺失序列對比分析

表2 Nsp2部分基因序列氨基酸同源性比對分析

圖4 Nsp2部分基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 ORF5基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

表3 ORF5基因序列氨基酸同源性比對分析

3 討論

PRRSV各分離株基因組序列存在不同程度的差異。不同地域分離株基因組序列分析顯示，PRRSV有2種基因型，即美洲型（以VR2332為代表株）和歐洲型（以LV為代表株），歐洲型分離株間的差異較小，北美洲型分離株間的差異相對較大。目前，國內(nèi)外已經(jīng)完成多株P(guān)RRSV的全基因組序列測定［7-8］，序列分析的結(jié)果表明，PRRSV的變異分布于整個基因組，尤以O(shè)RF5基因和Nsp2基因的變異最大［9-10］。因此，對這2個基因變異的分析在一定程度上可以反映病毒基因組序列變異的情況，在研究上常作為比較PRRSV變異的靶基因。

本研究通過對HBHS株和HBXN株的Nsp2基因序列分析表明：此次分離的兩株高致病性PRRSV HBHS株和HBXN株都分別缺失了3個堿基和87個堿基，即共缺失30個氨基酸，這與國內(nèi)分離的高致病性 PRRSV毒株 JXA1、GD2007、GD2008的Nsp2高變區(qū)堿基的缺失是一致的，且具有很高的同源性。序列比對發(fā)現(xiàn)此次分離到的兩個分離株之間也具有很高的同源性，高達(dá)98.8%。所分離毒株臨床上具有高致病性。

PRRS不同分離株的核苷酸序列存在廣泛而且明顯的變異，ORF5基因最容易發(fā)生變異，由其編碼的GP5蛋白是PRRSV所有結(jié)構(gòu)蛋白中具有較強(qiáng)抗原性的蛋白，不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生與病毒的中和反應(yīng)呈顯著相關(guān)的中和抗體，還在引起特異性細(xì)胞免疫、阻止肺泡巨噬細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多個方面發(fā)揮著重要作用［11］。因此，ORF5基因的變異，引起其編碼的GP5蛋白的變化，帶來抗原性的改變，最終導(dǎo)致PRRSV相關(guān)特性的改變。這可能是免疫豬群不能抵抗變異毒株攻擊而發(fā)病的原因之一。通過對ORF5序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究中所分離的HBHS株和HBXN株的ORF5序列與國內(nèi)分離的高致病性 PRRSV毒株 JXA1、GD2007、GD2008、WUH1、HUN4、HK13、HB-1、NB-04 的遺傳距離很近，同處一個基因群中，而與CH-1a等經(jīng)典毒株較遠(yuǎn)。說明了分離的毒株ORF5基因在很大程度上發(fā)生了變異，該結(jié)論為研究流行毒株的變異情況及選擇合理的毒株制備疫苗進(jìn)行免疫，以及預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

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