微生物冷凍干燥保藏技術(shù)的影響因素分析

李偉杰，蔣桃珍，魏財(cái)文，豈曉鑫，田 野

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

微生物保藏就是對(duì)活體微生物群體進(jìn)行有效的保藏，微生物保藏的基本目的是保持其純度、活性并盡可能減少變異，最終目的是為科技創(chuàng)新和生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供有效的支撐。目前用于微生物的保藏技術(shù)可以分為四類:傳代法、干燥法、冷凍法和冷凍干燥法［1］，其原理主要是運(yùn)用干燥、低溫和隔絕空氣的手段，抑制微生物的新陳代謝，使其生命活動(dòng)處于半永久性休眠狀態(tài)，從而達(dá)到保藏的目的。現(xiàn)在簡(jiǎn)易的保藏方法，例如定期移植法、液體石蠟法，在很多實(shí)驗(yàn)室和保藏機(jī)構(gòu)還在使用，而砂土保藏法、硅膠干燥法等簡(jiǎn)易的保藏方法，已經(jīng)很少見(jiàn)到。當(dāng)今公認(rèn)的最安全、最可靠的長(zhǎng)期保存微生物的方法是冷凍法和冷凍干燥法，它們適用于大多數(shù)微生物的保藏。

冷凍干燥保藏技術(shù)適用范圍廣泛，除少數(shù)不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用外，其它微生物如細(xì)菌、病毒等均可采用此方法。其基本原理是微生物和凍干保護(hù)劑在低溫下先行凍結(jié)至共晶點(diǎn)以下，然后在適當(dāng)?shù)恼婵窄h(huán)境下進(jìn)行冰晶升華干燥，隨后進(jìn)行解吸干燥，除去部分結(jié)合水，從而獲得干燥的微生物產(chǎn)品，最后進(jìn)行真空熔封，在低溫、避光環(huán)境下保藏［2］。

1 影響冷凍干燥保藏的因素

1.1 菌齡和細(xì)胞濃度 凍干微生物的菌齡對(duì)其冷凍干燥保藏后細(xì)胞存活率有重要影響，例如鼠李糖乳桿菌在生長(zhǎng)的穩(wěn)定期進(jìn)行冷凍干燥，細(xì)胞存活率為31% ～50%，而在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為14%，在生長(zhǎng)遲緩期僅為2%［3］。研究表明:生長(zhǎng)時(shí)期不同，細(xì)胞的生理狀態(tài)差異很大，對(duì)外界環(huán)境條件的反應(yīng)程度不一。處于穩(wěn)定期的細(xì)胞或成熟的孢子對(duì)不良環(huán)境具有較強(qiáng)的抗性，因而，保藏不產(chǎn)芽孢細(xì)菌、酵母菌，應(yīng)采用對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定期初期的細(xì)胞;而保藏產(chǎn)芽孢細(xì)菌、放線菌和霉菌，要用成熟的孢子，相應(yīng)的時(shí)期為產(chǎn)芽孢細(xì)菌在細(xì)胞的分化階段、放線菌在生長(zhǎng)II期，霉菌在無(wú)性孢子繁殖期和有性孢子繁殖期。在冷凍干燥保藏技術(shù)中，為保證在使用時(shí)有足夠數(shù)量存活的細(xì)胞，凍干前通常要加大細(xì)胞密度，細(xì)菌和放線菌濃度一般在108～109CFU/mL，酵母菌和霉菌孢子的濃度一般要大于107CFU/mL。

1.2 凍干保護(hù)劑 凍干保護(hù)劑可分為小分子保護(hù)劑(如低聚糖類、醇類和緩沖鹽類)和大分子保護(hù)劑(如蛋白質(zhì)、多肽類和多糖類)。小分子保護(hù)劑，一般具有很強(qiáng)的親水性，分子結(jié)構(gòu)中含有氫鍵，在冷凍或干燥過(guò)程中，可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。而大分子保護(hù)劑通過(guò)“包裹”形式保護(hù)菌體，同時(shí)，促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用［4］。保護(hù)劑類型的選擇主要取決于菌株的生物學(xué)特性，脫脂牛乳、血清、蔗糖等既是有效的凍干保護(hù)劑又是很好的低溫保護(hù)劑。研究表明利用海藻糖作為凍干保護(hù)劑可以提高微生物的存活率［5］，其中一個(gè)重要原因是海藻糖的玻璃化溫度較高，而玻璃化溫度越高，凍干樣品在溫度升高時(shí)更容易保持穩(wěn)定。由于蛋白的玻璃化溫度相對(duì)更高，因此在微生物保藏中經(jīng)常把蛋白和糖的混合物作為凍干保護(hù)劑。Abadias等［6］試驗(yàn)表明 Candida sake利用脫脂牛乳和碳水化合物作保護(hù)劑，菌株細(xì)胞存活率可達(dá)85.9%。

1.3 冷凍干燥工藝

1.3.1 預(yù)凍 預(yù)凍過(guò)程一方面要保護(hù)微生物的主要性能不變，另一方面要獲得凍結(jié)后微生物有合理的結(jié)構(gòu)，以利于水分的升華。預(yù)凍效果主要由3個(gè)方面決定:預(yù)凍速率、預(yù)凍最低溫度、預(yù)凍時(shí)間。(1)預(yù)凍速率是影響微生物存活率的重要因素，由于微生物細(xì)胞對(duì)水分的滲透率不同，導(dǎo)致不同微生物最佳預(yù)凍速率不同。快速凍結(jié)，胞內(nèi)的水分來(lái)不及通過(guò)細(xì)胞膜滲出，胞內(nèi)溶液過(guò)冷而結(jié)冰，細(xì)胞的體積膨大，最后導(dǎo)致細(xì)胞破裂;慢速凍結(jié)，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液的濃度提高，胞內(nèi)的水分便大量向外滲透，導(dǎo)致細(xì)胞的劇烈收縮，造成細(xì)胞損傷［7］。實(shí)驗(yàn)證明，快速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率低，解吸速率快，慢速凍結(jié)反之。實(shí)際上一般凍干微生物樣品的預(yù)凍速率介于快凍與慢凍之間。就細(xì)菌而言，通常采用分段降溫速率，從室溫快速降到約4℃，然后每分鐘降低1℃至－40℃，最后按每分鐘3～5℃的速率降至－70℃左右［7］。(2)預(yù)凍最低溫度一般應(yīng)低于溶液共晶點(diǎn)溫度，即在共晶點(diǎn)溫度以下8～10℃。共晶點(diǎn)與微生物類群、保護(hù)劑的種類和濃度有關(guān)。(3)適宜的預(yù)凍時(shí)間是指一次干燥之前所有的微生物樣品均已凍實(shí)所需要的時(shí)間，以免因抽真空而引起噴瓶。若預(yù)凍時(shí)微生物樣品凍結(jié)不實(shí)，凍干后微生物樣品表面凹凸不平。一般要求凍干瓶裝厚度不超過(guò)10 mm。微生物樣品的固體含量一般為2% ～10%，如低于2%，凍干微生物樣品結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能就可能不穩(wěn)定，而高于10%則凍干不易成功，且復(fù)水也比較困難［8］。

1.3.2 一次干燥(升華干燥) 一次干燥主要是使微生物樣品中凍結(jié)的自由水升華逸出。升華干燥的時(shí)間與微生物樣品的種類、分裝的厚度及升華時(shí)提供的熱量有關(guān)。凍干期間水升華的驅(qū)動(dòng)力為微生物樣品與冷阱之間的溫差。通常升華干燥階段冷阱溫度為－60℃(至少比微生物樣品溫度低20℃)。解吸干燥階段冷阱溫度要求低至－80℃，這樣獲得的凍干品殘留水量較少。為達(dá)到較快的干燥速度，微生物樣品溫度要求盡可能高，但必須低于共晶點(diǎn)溫度或崩解溫度，以防止微生物樣品熔化或崩解，出現(xiàn)干縮和鼓泡現(xiàn)象，造成微生物凍干樣品溶解性差［9］。在凍干時(shí)主要靠傳導(dǎo)方式提供熱量，凍干品的熱量主要從擱板獲得，擱板與微生物樣品之間有效的熱傳遞與界面溫度所對(duì)應(yīng)的飽和蒸汽壓和干燥室內(nèi)真空度之差有關(guān)。升華階段的真空度在10～30 Pa時(shí)，較有利于熱量的傳遞和升華的進(jìn)行。若壓強(qiáng)過(guò)低，則對(duì)傳熱不利，微生物樣品不易獲得熱量，升華速率反而降低，對(duì)設(shè)備的要求也更高;而當(dāng)壓強(qiáng)過(guò)高時(shí)，微生物樣品內(nèi)冰的升華速度減慢，微生物樣品自身溫度會(huì)上升，當(dāng)高于共晶點(diǎn)溫度時(shí)微生物樣品將發(fā)生熔化而導(dǎo)致凍干失敗。干燥室壁溫、底盤側(cè)邊高度、安瓿瓶的排列方式均會(huì)影響傳熱效果，并將影響升華速率［10］。

1.3.3 二次干燥(解吸干燥) 二次干燥主要是去除部分結(jié)合水。這部分水主要靠范德華力和氫鍵吸附在微生物樣品上，需要更多的能量才能將其除去。升華干燥后微生物樣品殘留水分通常在10%左右，解吸干燥后殘余水分一般應(yīng)低于2%。凍干微生物樣品中的殘留水分對(duì)凍干微生物質(zhì)量影響很大，殘留水分過(guò)多，微生物容易失活，穩(wěn)定性變差。為控制凍干微生物樣品中的殘留水分，解吸干燥時(shí)應(yīng)在保持微生物樣品活性的條件下選擇允許的最高溫度，真空度需盡可能提高，一般這一過(guò)程需4～6 h。自動(dòng)化較高的凍干機(jī)可通過(guò)壓力升高試驗(yàn)以獲得對(duì)殘留水分進(jìn)行控制的相應(yīng)數(shù)據(jù)。微生物冷凍干燥一般工藝曲線見(jiàn)圖1［11］，在實(shí)際應(yīng)用中要根據(jù)不同微生物種類和選用的凍干保護(hù)劑做適當(dāng)?shù)膬?yōu)化和調(diào)整。

圖1 冷凍干燥一般工藝曲線

2 凍干微生物樣品的常見(jiàn)問(wèn)題及解決措施

2.1 噴瓶現(xiàn)象 噴瓶現(xiàn)象是由于微生物樣品在預(yù)凍時(shí)，沒(méi)有完全凍實(shí)就抽真空的緣故。解決方法是適當(dāng)延長(zhǎng)預(yù)凍時(shí)間。

2.2 干縮現(xiàn)象 干縮現(xiàn)象是由于微生物樣品在升華干燥過(guò)程中，溫度超過(guò)了共晶點(diǎn)或崩解溫度，出現(xiàn)局部熔化，由液體蒸發(fā)為氣體，造成體積縮小，或者干燥產(chǎn)品溶入液體之中，造成體積縮小。解決方法是降低加熱溫度和提高凍干箱的真空度。

2.3 剩余水分不合格現(xiàn)象 剩余水分不合格是由于解吸干燥的時(shí)間不夠，或微生物樣品達(dá)到允許的最高溫度后未恢復(fù)高真空。解決方法是延長(zhǎng)解吸干燥的時(shí)間，并在產(chǎn)品達(dá)到允許的最高溫度后恢復(fù)高真空。

2.4 溶解性差的問(wèn)題 產(chǎn)品干燥過(guò)程中發(fā)生局部濃縮，例如產(chǎn)品內(nèi)部有夾心的硬塊，它是在升華中發(fā)生熔化，產(chǎn)生蒸發(fā)干燥濃縮造成的。解決方法是適當(dāng)降低板層溫度，提高凍干箱的真空度或延長(zhǎng)升華干燥的時(shí)間［9］。

3 結(jié)語(yǔ)

微生物冷凍干燥保藏技術(shù)涉及生物學(xué)、機(jī)械、制冷、真空和自動(dòng)化控制等多門學(xué)科，影響因素眾多，包括菌齡、細(xì)胞濃度、凍干保護(hù)劑、冷凍干燥工藝、安瓿瓶的規(guī)格等。隨著微生物冷凍干燥保藏技術(shù)與設(shè)備的日益完善，以及對(duì)影響微生物冷凍干燥保藏各種影響因素的深入研究，可以使我們不斷提高微生物保存的質(zhì)量，延長(zhǎng)其保存期限，進(jìn)而對(duì)其質(zhì)量加以控制。

［1］李 雁，鄭從義.微生物物種多樣性的保護(hù)與其資源保藏［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(3):4－6.

［2］霍 貞.冷凍干燥的工藝流程及其應(yīng)用［J］.干燥技術(shù)與設(shè)備，2007，5(5):261 －264.

［3］Corcoran B M，Ross R P，F(xiàn)itzgerald G F，et al.Comparative survival of probiotic lactobacilli spray－dried in the presence of prebiotic substances［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(5):1024－1039.

［4］Palmfeldt J，Radstrom P，Hahn－Hagerdal B.Optimisation of initial cell concentration enhances freeze－drying tolerance of Pseudomonas chlororaphis［J］.Cryobiology，2003，47(1):21 －29.

［5］楊曉菲，王 棟.副豬嗜血桿菌凍干保護(hù)劑的研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47(8):18－21.

［6］Abadias M，Teixido N，Usall J，et al.Viability，efficacy，and storage stability of freeze－dried biocontrol agent Candida sake usingdifferent protective and rehydration media［J］.Journal of Food Protection，2001，64(6):856－861.

［7］陶天申，楊瑞馥，冬秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:73－75.

［8］劉洪斌，吳 強(qiáng)，鄭桂軍.獸醫(yī)生物制品冷凍真空干燥技術(shù)研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2004，(10):12－14.

［9］林澤培.耐熱保護(hù)劑活疫苗凍干技術(shù)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2009，43(3):58－60.

［10］Gan K H，Bruttini R，Crosser O K，et al.Freeze－drying of pharmaceuticals in vials on trays:effects of drying chamber wall temperature and tray side on lyophilization performance［J］.Int J Heat and Mass Transfer，2005，48(9):1675.

［11］徐成海，張世偉，彭潤(rùn)玲，等.真空冷凍干燥的現(xiàn)狀與展望(二)［J］.真空，2008，45(3):1－13.