等離子技術在弗氏鏈霉菌和側耳屬誘變選育中的應用

王忠中，張 萍，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101)

抗生素發酵生產中，菌種的發酵水平是提高產能的至關重要的因素，而菌種的發酵水平可通過大量的篩選、誘變、基因工程手段進行提高［1］。所以，各生產企業、研究機構都在菌種篩選誘變方面進行大量的研究和開發，并取得很好的效果。越來越多的技術被應用到菌種選育當中［2］。但傳統的方法由于多次重復使用導致誘變效果不明顯，而一些新技術條件苛刻、費用昂貴，很難在工業生產中普及。

常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma，簡稱ARTP)是近幾年來發展起來的一種等離子體源，能夠在大氣壓下產生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子(包括處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)濃度的等離子體射流［3］。科學研究表明，等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細胞表面電勢下降;改變細胞壁/膜的結構及通透性;能夠對菌株/植株/細胞等的遺傳物質造成損傷，并誘發生物細胞啟動SOS修復機制，進而使微生物基因序列及其代謝網絡顯著變化，最終導致微生物產生突變，已在生物誘變中廣泛應用［4－5］。

本文利用氦氣源ARTP分別對弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)和側耳屬(Pleurotus sp.)進行了不同時間的照射，統計死亡率，并對誘變后的菌株進行篩選，確定了ARTP對兩種不同微生物的最佳照射時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 泰樂菌素產生菌弗氏鏈霉菌，編號12－662，斜面孢子;泰妙菌素生產菌側耳屬，編號12－142，斜面菌絲。兩菌種由寧夏泰瑞制藥股份有限公司種子室保存。

1.1.2 主要設備 室溫常壓等離子體誘變系統(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;旋轉搖瓶機，XDW25/96型，四川長征制藥機械廠;紫外可見分光光度計，UV1800、高效;液相色譜儀，日本島津公司;恒溫、凈化工作系統。

1.1.3 試劑及原料

1.1.3.1 氦氣，純度 99.99%;麩皮，自制;葡萄糖、氯化鈷、磷酸氫二銨、硫酸鎳、硫酸鋅、氯化鎂等均為分析純，魚蛋白胨、酵母膏為北京奧博星生物試劑公司;玉米漿、豆餅粉、魚粉、玉米粉、玉米蛋白粉為本地農副產品。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將弗氏鏈霉菌斜面孢子用無菌水洗下搖勻，制備成孢子懸液。將側耳屬斜面菌絲鏟下移入組織研磨器中，加入無菌水研磨均勻［6］。

1.2.2 照射菌膜制備 分別取制備好的菌懸液1滴，加到專用不銹鋼片上，涂均勻，在無菌條件下干燥形成菌膜。

1.2.3 等離子誘變 開啟ARTP誘變系統，調整氦氣供氣壓力在0.1～0.2 MPa，設定入射氣流為8.0 SLM，功率為140 W，將載有菌膜的鋼片放入誘變系統操作室，調整至發射口正下方，距發射口2 mm，照射時間由20 s到400 s遞增。由于弗氏鏈霉菌是用孢子懸液進行誘變，抵抗能力強，誘變時間從120 s開始，以30 s間距遞增;側耳屬是菌絲片段進行誘變，抵抗力弱且不耐長時間干燥，誘變時間從20 s開始，以5 s間距遞增。每組設兩個鋼片，將照射后的菌膜置同一試管制備菌懸液。同時以不照射的兩個載有菌膜的鋼片為對照組。

1.2.4 誘變菌株的分離與培養 將照射后的及對照組鋼片分別置于滅菌試管中，加入1 mL無菌生理鹽水劇烈震蕩，洗下菌膜并搖勻，按10倍稀釋法稀釋至10－5倍，每個稀釋度取0.1 mL涂布接種平板5個。置培養箱中按照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業內控標準控制工藝培養形成單菌落［6－7］。

1.2.5 單菌落的挑取和死亡率計算 待單菌落培養好后，選擇挑取典型形態的單菌落進行擴培和篩選，并對平板上的菌落進行計數。計算每組平均菌落數相對于對照組的死亡率。

1.2.6 搖瓶篩選 將擴培后的單菌落斜面挖塊接入發酵瓶中進行搖瓶發酵初篩，同時以原誘變前斜面做對照，發酵結束測定發酵液效價，泰樂菌素發酵液用分光光度計法，泰妙菌素發酵液用高效液相色譜法。根據初篩結果挑選高效價菌株進行復篩，復篩采用二級發酵，即將斜面挖塊接種到種子瓶培養基中，培養成熟后按10%接種量將種子液接入發酵瓶培養基中進行搖瓶發酵。每個單菌落斜面接1個種子瓶，每個種子瓶平行接3個發酵瓶，同時進行搖瓶發酵。

1.2.7 傳代穩定性考察 經過復篩高于對照的菌株進行傳代考察穩定性，每個菌株三代，分別用F0、F1、F2、F3表示原種、一代、二代、三代。每代斜面接1個種子瓶，每個種子瓶平行接5個發酵瓶，同時進行搖瓶發酵，以F0代效價為對照，考察各代斜面平均效價和均勻情況。

2 結果與分析

2.1 死亡率與照射時間的關系 結果見圖1。

圖1 死亡率與照射時間關系圖

從圖1可以看出，不同菌種對等離子的耐受情況明顯不同，弗氏鏈霉菌在150 s以內死亡率不足30%，150 s以后死亡率迅速上升，270 s時達92.8%;而側耳屬在20 s時死亡率已達70%以上并隨著照射時間的增加迅速上升，35 s達95%以上，40 s以后全部死亡。

2.2 誘變菌株初篩結果 兩種菌在誘變后其菌落形態沒有發生明顯變化，而菌落大小與菌落多少有關，不能直接從菌落形態觀察變異情況。分別從誘變后的平板中挑取100株菌落擴培成斜面進行初篩。弗氏鏈霉菌210 s以前各組平板中菌落比較密、比較小，無法挑取單個菌落，故未進行篩選。初篩結果統計如表1，相對效價見圖2。

表1 誘變菌株的初篩結果統計

圖2 初篩效價與照射時間關系圖

從初篩結果看，高效價比例(正變率)較高的照射時間段其誘變死亡率并不是很高，集中在80%～90%，弗氏鏈霉菌和側耳屬兩種菌基本接近，對應照射時間分別為240～270 s和25～30 s;同時在該照射時間段下，正突變菌株初篩效價高于對照的幅度較大，大多數超過5%，有明顯趨勢，說明等離子誘變中，死亡率太高反而不利于菌種正突變。

2.3 誘變株復篩結果 分別將初篩中高于對照的菌株接入發酵瓶進行搖瓶復篩，結果見表2和表3。

表2 弗氏鏈霉菌誘變株復篩效價結果 u/mL

表3 側耳屬誘變株復篩效價結果 u/mL

表2 結果顯示，弗氏鏈霉菌270 s照射組選出的62號菌株復篩效價高于對照10.4%;表3結果顯示，側耳屬25 s照射組選出的28號菌株復篩效價高于對照9.6%。

2.4 穩定性考察結果 分別將弗氏鏈霉菌62號菌株和側耳屬28號菌株傳三代培養成斜面，接入發酵瓶進行穩定性考察，結果見表4。

表4 篩選株傳代穩定性考察

表4 穩定性結果顯示，弗氏鏈霉菌隨著代次增加，發酵能力逐漸減低，F3代斜面效價低于 F0代4.9%，整體穩定性較好。側耳屬在F1代時，效價明顯高于F0代，但到F2代后迅速降低，低于F0代，三代內最大差異3.9%。

3 討論

3.1 從死亡率分析，不同菌種的耐受程度有較大區別，與菌種特性有關，弗氏鏈霉菌為放線菌，其孢子耐受能力強，而側耳屬為不產孢子擔子菌，菌絲較脆弱，隨著作用時間的延長，很快死亡。但利用ARTP誘變菌種，死亡率曲線相對較為平緩，有利于誘變功率和作用時間的掌握。

3.2 在制備菌膜時不可使用生理鹽水，以免干燥后無機鹽晶體析出，誘變時飛濺和導電。

3.3 該方法離子源能量穩定，誘變過程中溫度維持在40℃以內，可有效防止菌種因高溫死亡或部分對溫度敏感的功能蛋白變性。

3.4 ARTP相對于其他物理化學誘變手段，主要優勢體現在誘變過程不產生有毒有害廢物，危險性小，誘變株培養不需要特殊防護［1］;與重離子束注入法相比，該方法操作簡便，不需要大型粒子加速器裝置，普通實驗室即可開展［8］;也不需要航天育種那樣受限制［9］，在生物育種方面有較好的應用前景。

本試驗采用ARTP技術進行誘變，弗氏鏈霉菌誘菌株復篩效價高于對照的占復篩數的47%，最高效價高于對照10.4%;側耳屬復篩效價高于對照的占復篩數的33%，最高效價高于對照9.6%，表明該方法誘變菌種有較好的效果。試驗最終確定弗氏鏈霉菌和側耳屬誘變的最佳照射時間分別為240～270 s和25～30 s。

［1］施巧琴，吳松剛.工業微生物育種學［M］.北京:科學出版社，2003.

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