不同輸血輸液方案對失血性休克大鼠腎功能及AQP2，BSC1的影響

李 凱，高 鳳，冷亞書，趙國慶，李龍云

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033）

本實驗針對大鼠重度失血性休克模型，采用臨床常用的混合輸血輸液策略，對比重度失血性休克及兩種液體復蘇方案對腎臟功能的影響，及與BSC1、AQP2蛋白的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為清潔級雄性SD大鼠，體重220－250g，由吉林大學動物實驗中心提供。鹽酸氯胺酮注射液，乳酸鈉林格氏液，羥乙基淀粉（130／0.4，萬汶，費森尤斯卡比）.AQP2、BSC1抗體為兔抗鼠抗體和辣根過氧化物標記羊抗兔IgG多克隆抗體購自Sigma公司；SP免疫組化試劑盒購自寶生物有限公司。全自動生化分析儀及比重儀購自徐州美康電子設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性重度失血性休克模型的建立[1]與分組實驗將雄性SD大鼠24只，隨機分為3組，每組8只。實驗前12h禁食、自由飲水。腹腔注射氯胺酮100mg／kg麻醉后，右側股動脈、股靜脈插管，股動脈插管經三通管連接水銀血壓計和玻璃注射器，供觀察血壓，經插管注射肝素鈉生理鹽水（500U、kg）抗凝，股靜脈插管供輸血輸液，術畢，動物穩定10 min，。C組僅行股動靜脈插管，其余兩組經股動脈20min內放血35%，使平均動脈壓（MAP）低于40 mmHg，60min后按不同方案輸入不同復蘇液體，維持MAP在80mmHg 30min。縫合血管，徹底止血后，縫合切口，保溫蘇醒。

1.2.2 標本采集 術后24h再次麻醉采樣。采集術前和術后24h尿液樣本，記錄尿量，檢測尿比重。采集術前及術后24h的血液送檢肌酐（Cr）及尿素氮（BUN），取血后迅速摘除大鼠左側腎臟，將取出的左腎標本置于冰上沿正中線分割成左右兩部分，其中一部分標本取材后放入10%福爾馬林溶液中固定以行病理學及免疫組織化學檢測，組織切片HE染色，光學顯微鏡觀察腎組織病理變化。依據Paller法[2]對腎小管損害程度進行評分。另一部分將腎臟于顯微鏡下分離出皮質和髓質后馬上放入液氮中凍存，1h后置于－80℃冰箱保存以行Western blot檢測。

1.2.3 生化指標檢測 標本集齊后生化分析儀測定BUN和Cr，比重計測量尿液比重。

1.2.4 免疫組織化學檢測BSC1、AQP2的表達腎臟石蠟標本切成3μm切片，經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后按SP試劑盒說明書操作。在200倍光鏡下觀察以細胞膜顯色棕黃色顆粒為陽性。

1.2.5 蛋白印跡（Western blot）腎組織加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液（250mM suCrose包含1mM EDTA，20μg／mlPMSF，1μg／ml pepstatinA，和1μg／ml leupetin pH 7.4）后勻漿（電動勻漿儀1 250rpm，5s），提取膜蛋白。應用蛋白分析試劑（Bio－Rad，USA）測定總蛋白濃度，50μg蛋白質溶于蛋白上樣緩沖液中煮沸5min，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120V）30min后，100V電泳1 h，將膠版上的蛋白帶轉至纖維素膜上（PVDF膜），將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的PBS液中于37℃下封閉1h，因蛋白分布的部位不同，皮質檢測AQP2，髓質檢測 BSC1，PBS沖洗后加入一抗（AQP2 1∶200，BSC1 1∶500）放置在搖床上4℃過夜，PBST洗膜后加入二抗（羊抗兔，稀釋度1：10000）孵育1h，加入PBS洗膜后掃描照相。

2 結果

2.1 尿量和尿比重改變 見表1。

表1 失血性休克損傷術前和術后24h尿比重及尿量變化（n＝8，±s）

表1 失血性休克損傷術前和術后24h尿比重及尿量變化（n＝8，±s）

＊與術前比較P＜0.05。

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2.2 血清BUN和Cr變化 見表2。

表2 失血性休克損傷術前和術后24hBUN和Cr變化（n＝8，±s）

表2 失血性休克損傷術前和術后24hBUN和Cr變化（n＝8，±s）

＊與術前比較P＜0.05。

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2.3 腎組織形態學改變見圖1，C組：腎單位結構完整，腎小球和腎小管未見明顯異常；LR及HES組：腎小球輕度淤血，間質充血水腫，少量腎小管上皮細胞水腫，空泡變性，刷狀緣扁平、皺縮、少量核深染、裸露，有少量中性粒細胞侵潤。腎小管Paller評分：與C組相比，HES組和LR組評分均顯著增加（P＜0.05）。但 HES組和LR組間無差異（P＞0.05），見圖2。

圖1 腎組織形態學改變（HE×400）

圖2 腎小管Paller評分，＊與C組比較P＜0.05，#與LR組比較P＞0.05）。

2.4 腎組織AQP2，BSC1免疫組化結果 見圖3、4，腎臟集合管細胞膜和髓袢升支粗段細胞膜有棕黃染色，分別為AQP2和BSC1表達。與C組比較，LR組和HES組BSC1、AQP2在腎臟缺血－再灌注損傷后染色較淺，HES組染色深于LR組。

2.5 腎組織AQP2，BSC1蛋白表達變化 Western blot結果示見圖5，AQP2的分子量位于29kDa和35－50kDa的蛋白帶，BSC1的分子量位于42kDa的蛋白帶。GAPDH的分子量位于45kDa的蛋白帶。與C組比較，LR組和HES組AQP2，BSC1表達顯著下調，HES組表達高于LR組。

圖3 腎臟內髓部集合管AQP2的表達

圖4 腎臟髓袢升支粗段BSC1表達

圖5 Western blot法檢測蛋白表達，＊與C組比較P＜0.05，#與LR組比較P＜0.05。

3 討論

嚴重創傷易導致急性失血休克，失血量達30%就可能危及患者的生命，嚴重失血性休克后短期內不積極救治死亡率達32.6%－59.5%[3]。目前休克后復蘇液體主要有晶體液和膠體液，由于晶體液和膠體溶液均不具備攜氧能力，且缺乏血小板和凝血因子，如果不復合輸注血制品，兩種液體的輸注量必然增大，進而引起凝血功能障礙，離子紊亂及加重腎功能障礙。以往的研究多為不復合輸血[1，4]，其結果不符合臨床實際，參考價值大大降低。本研究選擇了臨床常用的復合輸血輸液方案，進行了不同方案差異的比較。

水通道蛋白是與水通透有關的細胞膜轉運蛋白，迄今已從哺乳動物中鑒定的水通道共有13種（AQP0～12）[5]，它們分布于不同的組織器官中，分別介導不同類型細胞膜的跨膜水轉運。AQP2只存在于腎臟，是腎臟集合管上皮細胞調節集合管對水通透性的主要水通道蛋白[6]。由于腎臟鈉水重吸收常為偶合過程，BSC1具有回吸收 Na＋、Cl－、K＋的功能，并參與尿液濃縮的過程[2]，二者在腎臟缺血－再灌注損傷后表達顯著減低，與缺血時間呈正相關[7]，其與失血性休克繼發的腎臟損傷的關系值得關注。

BUN、Cr是判定腎功能損傷嚴重程度的重要指標，能夠直接反映腎細胞的受損情況。與對照組相比，失血性休克補液后，兩組大鼠都出現了BUN、Cr明顯升高，尿比重升高等腎功能障礙的表現，與腎細胞上皮細胞病理改變相吻合，而兩組間病理改變沒有差異。本研究同時顯示，失血性休克補液后，BSC1、AQP2表達下調，這表明BSC1、AQP2在失血性休克所致腎損傷中起著非常重要的作用。結果與Basile法[8]夾閉腎動脈所致腎缺血再灌注損傷模型的結論相類似，提示兩種模型的損傷機制和研究結論可以相互借鑒。

兩種輸血輸液方案間對比，常規的腎功能指標及病理損傷沒有差異。但HES組與林格組相比，BSC1、AQP2下降程度有所減低，提示二者可能是腎臟損傷的更為敏感的指標，而HES組比林格組在該方面的優勢，可能與HES可穩定內皮細胞膜，抑制中性粒細胞的黏附，維持循環穩定作用更為持久有關[9]。故提示臨床工作中對重度失血性休克的病人，可以更多的選擇HES與血制品一起使用。

[1]李 濤，劉良明，刁有芳，等.不同液體對失血性休克大鼠復蘇效果的影響[J].第三軍醫大學學報，2009，31（6）：467.

[2]Wang W，Kwon TH，Li C，et al.Reduced expression of Na－K－2Cl cotransporter in medullary TAL in vitamin D－induced hypercalcemia in rats[J].Am J Physiol Renal Physiol，2002，282（1）：33.

[3]劉良明，胡沛紅.嚴重創傷休克的液體復蘇新進展[J].中國危重病急救醫學，2003，15（5）：314.

[4]于幫旭，劉佳寧，李 堃，等.延遲液體復蘇對失血性休克大鼠炎性反應的影響[J].實用醫學雜志，2008，24（13）：2214.

[5]Noda Y，Sasakis S.Molechlar mechanisms and drug development in aquaporin water channel disease molecular mechanism of water channel aquaporin－2trafficking[J].Pharmacol Sci，2004，96（3）：249.

[6]Loffing J，Macher A.Localization of epithelial sodium channel and aqpuaporin－2in rabbit kidney cortex[J].AmJ Physiol Renal Physiol 2000，278（4）：F530.

[7]Kim GH，Ecelbarger C，Knepper MA，et al.Regulastion of thick ascending limb ion transporter abundance in response to altered acid／base intake[J].J Am Soc Nephrol，1999，10（5）：935.

[8]Basile DP，Dono hoe D，Cao X，et al.Resistance to ischemic acute renal failure in the Brown Norway rat：a new model to study[J].Cytoproection Kidney Int，2004，65（6）：2201.

[9]Neff TA，Doelberg M，Jungheinrich C，et al.Repetitive large dose infusion of the novel hydroxyethyl starch130／0.4in patients with severe head injury[J].Anesth Analg，2003，96（5）：1453.