飛秒激光直寫生物凝膠模板原位合成納米粒子

劉東旭，夏 虹，孫允陸，陳岐岱，董文飛

(吉林大學集成光電子國家重點聯合實驗室，吉林長春130012)

1 引言

聚合物微結構在光子學［1］、微流變學［2］、組織工程［3］和生物分子分析工程［4］等領域有廣泛的應用。它們的性能與其形狀，尺寸以及化學性質密切相關。例如，作為載體應用于載藥工程的聚合物顆粒［5］，其流動性，分解性和被吞噬能力取決于它們的幾何形狀和尺寸［6］。通過改變聚合物結構的形狀和組分［7-9］，可以高效地修飾其擴散、懸浮流變性、自組裝等特性。因此，亟須開發新型制備工藝來實現具有不同形狀和化學性能的聚合物微結構［10-11］，如低表面粗糙度及三維任意可控幾何形狀的聚合物微納結構。采用拉伸聚合物微結構［12］、非浸潤模板的復制［13］、光刻［14］和微流體［2，15］等傳統方法，能夠連續制備具有多種形貌和化學性質的聚合物微結構。然而這些方法往往只局限于簡單的規則圖形或二維結構，如何實現聚合物微結構的三維加工是相關領域的研究重點。

飛秒激光直寫是一種新興的先進微加工方法，基于多光子吸收原理，它可以制備任意復雜形狀和低于衍射極限尺寸的三維結構［16］。因此，其在聚合物微加工中具有不可替代的優勢。然而，由于聚合物修飾組分的加入(如加工溶液中混有固態的功能性納米粒子)，會導致激光在聚焦區域的散光，嚴重影響加工效果。

為了解決以上問題，本文介紹了一種飛秒激光直寫與原位納米粒子合成相結合的方法，先由飛秒激光直寫摻有功能液體組分的加工溶液，制備出具有特定結合位點的水凝膠模板，然后進行原位納米粒子合成，成功制備了具有幾十μm量級尺寸和10 nm量級粗糙度同時具有三維復雜形貌和特定化學性質的水凝膠微結構。

2 材料與方法

2.1 實驗試劑和儀器

實驗所需試劑:低聚物聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn=575 g/mol)，丙烯酸(AA)和光引發劑亞甲基藍(MB)，Tween 20購自美國 Sigma-Aldrich公司，FeCl3，AgNO3，NaOH，氨水(NH4OH)購自北京化工有限公司。實驗中所用超純水由Threestage Milli-Q Plus 185系統凈化，電阻率為18.2 MΩ·cm。所有化學品均直接使用，不需要進一步提純。

實驗所需儀器:鈦藍寶石飛秒激光振蕩器Femtosecond laser(Spectra Physics 3960-X1BB)，泵浦光源波長532 nm，功率7.3 W，穩定輸出功率1.4 W，重復頻率 80 MHz，輸出脈沖 120 fs，波長800 nm，單脈沖能量20 nJ。緊聚焦油浸加工物鏡，NA=1.35，60×。壓電平臺 PZT(Physik InstrumenteP-622ZCD)。數 字 攝 像 頭 CCD(DV100，10 Moons)。

2.2 飛秒激光加工原理

飛秒激光加工基于多光子吸收原理，主要為雙光子吸收過程。這一過程的預言首先由Maria GEppert-Mayer在 1931 年從理論上提出［17］，其取決于光強度的非線性。發生多光子吸收的基本條件是一次吸收兩個或更多的光子，因此可以通過一個緊聚焦的油浸顯微物鏡將超快激光光束匯聚，焦點體積內的材料發生光化學或光物理過程而進行局域化的轉變。通過移動焦點在材料中的位置可以實現三維加工。此外，調節加工閾值能夠使加工精度突破衍射極限，從而達到亞100 nm的分辨率。

2.3 生物凝膠模板的制備

圖1 實驗示意圖Fig.1 Scheme of the laser fabrication

如圖1所示，將質量分數為62.5%聚乙二醇二丙烯酸酯，12.5%丙烯酸，0.075%亞甲基藍溶于超純水中，在25℃的水浴中超聲5 min，使得所有的化學組分分散均勻，制成激光加工預聚物溶液。然后用量程為100 μL的移液槍量取20 μL預聚物溶液滴于24 mm×50 mm規格的蓋玻片上。在使用前此蓋玻片需經過嚴格的清洗。先是用丙酮、乙醇、去離子水各清洗15 min，然后在烘干箱中烘干5 min，并在蓋玻片上用無色玻璃膠圈出5 mm×5 mm大小的區域，方便固定加工溶液以及后期表征。

將緊聚焦油浸加工物鏡(NA=1.35，60×)固定在壓電平臺底部，用注射器吸取松柏油滴在加工物鏡鏡頭上，然后將有加工預聚物溶液的蓋玻片放在壓電平臺上，調節Z軸方向的機械旋鈕，使得蓋玻片與鏡頭之間的距離適中，方便調節激光光斑。選取適當的激光加工參數，制備出生物凝膠模板。

2.4 原位合成納米粒子

如圖1所示，將激光加工后的蓋玻片取下，用擦鏡紙擦去蓋玻片底部的松柏油，然后置于60 mm×30 mm規格的稱量瓶中(由于加工后的結構聚合成固體，相當于光刻膠中的負膠，因此洗去未聚合溶液的過程稱為顯影)，在去離子水中顯影20 min，并用水漂洗。充分顯影后的生物凝膠模板置于0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中10 min，使COOH基團變成 COO－基團，然后用0.5%Tween 20溶液清洗5次以達到中性pH值。

0.2 mol/L FeCl3溶液和1 mol/L AgNO3溶液是在氮氣保護的條件下制備的。將金屬鹽溶液滴加到生物凝膠模板上，約30 min，使金屬離子和COO－基團充分螯合。隨后用氨水調節pH至適當值，并用0.5%Tween 20溶液清洗5次。

2.5 實驗表征

本實驗使用場冷發射掃描電子顯微鏡JSM 7500(JEOL，Tokyo，Japan)進行微結構的形貌表征。加速電壓為 5.0 keV，濺射金層厚度為10 nm，工作模式 SEM，WD 8 mm。能譜儀 EDS(JSM 7001F能量色散X射線分析)表征金屬納米粒子。光學顯微鏡型號為Motic BA400。

3 結果與討論

3.1 溶液組分對生物凝膠模板的影響

為了保證聚合物微結構的生物相容性，選擇生物相容性極好的聚乙二醇二丙烯酸酯作為主體材料，吸收峰在紫外光區的亞甲基藍作為光敏劑，同時通過加入丙烯酸在聚合物微結構中引入COOH基團，而COOH基團的引入導致溶液激光加工性能變差。聚丙烯酸是強吸水材料，在自由基聚合時會強烈吸水而導致單點曝光形成的像素點膨脹變形，從而不能得到程序設定的結構。因此，需要減少丙烯酸在溶液中的比重。在本工作中通過先用只含有聚乙二醇二丙烯酸酯的溶液進行參數優化，在最優的配比條件下，固定預聚物的含量，然后逐漸增加丙烯酸組分比例的辦法，使得結構在形貌可以接受的情況下，得到最多的COOH基團(即溶液組分中丙烯酸含量最大值)。

圖2是溶液組分優化后的生物凝膠模板，此時聚乙二醇二丙烯酸酯為62.5%，丙烯酸為12.5%，亞甲基藍為0.075%。生物凝膠模板的結構完整性和精細程度都較好，而COOH基團的含量也足夠多。

圖2 復雜結構的生物凝膠模板Fig.2 Complex structure of biological gel template

3.2 激光參數對生物凝膠模板的影響

生物凝膠模板的制作是采用飛秒激光直寫的方式，通過單點曝光形成單個像素點疊加成所設計的結構［18］。因此，影響單個像素點的激光條件參數將直接影響生物凝膠模板的表面形貌和結構完整程度。高的激光功率和長的單點曝光時間都使單個像素點充分曝光，有利于形成致密的結構，然而它們卻存在不同，盡管長的單點曝光時間加工的效果更好，但將會導致整個加工過程耗時量增加，不利于快速制備結構。大的激光功率往往因為超過加工閾值而使熱效應顯著，導致結構變差甚至失效。因此，通過固定單一變量法，來優化加工參數“窗口”，對應點間距為100 nm的結構，單點曝光時間最優參數在100～400 μs之間，激光功率在16～28 mW之間。

3.3 Fe納米粒子的原位合成

圖3 生物凝膠模板進行鐵納米粒子原位合成前后的能譜儀表征((a)～(f))分別為未進行原位合成時電鏡照片及C、O、Si、Fe的分布情況((g)～(i))分別為原位合成后電鏡照片及 C、O、Si、Fe的分布情況Fig.3 EDS characterization before and after the iron nanoparticles in-situ synthesis in the bio-gel template((a)～ (f))，the SEM image and the distribution of the elements of C，O，Si and Fe before in-situ synthesis((g)～(i))The SEM image and the distribution of the elements of C，O，Si and Fe after in-situ synthesis

圖3是飛秒激光直寫后的方塊形生物凝膠模板對Fe納米粒子的原位合成。圖3(a)～3(f)是未經過原位合成的生物凝膠模板的能譜儀表征。圖3(a)為SEM圖像，可以看到未經過原位合成的生物凝膠模板表面光滑平整，內部插圖為不同顏色分別代表C、O、Si、Fe等元素。圖3(b)整體顏色分布圖，圖3(c)為C元素分布，由于生物凝膠為有機物，因此有C元素呈明顯的方形分布。而圖3(d)為O元素分布，由于凝膠模板加工在蓋玻片上，蓋玻片主要成分為SiO2，因此O元素在這個圖中都有分布，而生物凝膠模板中有聚乙二醇二丙烯酸酯，其中也含有O元素，故圖中O元素在方塊微結構的區域含量大于背景區域含量，綠顏色較深。而對于Si元素，則只存在于蓋玻片上，平均分布于圖3(e)中。圖3(f)為Fe元素的表征，可以看出由于蓋玻片和結構中均不含Fe元素，因此，圖中只有部分噪點，而無明顯的Fe元素分布現象。

圖3(g)～3(i)是經過Fe納米粒子原位合成后的表征。由圖3(g)可以看出在經過Fe納米粒子原位合成后，生物凝膠模板表面變的粗糙，而從圖3(h)～(k)可以看出，微結構中的Fe納米粒子對能譜儀的X射線有很強的散射作用，從而出現明顯的陰影區域。圖3(i)則直接證明結構中Fe元素集中分布在生物凝膠模板中。

圖4 多次原位合成納米粒子后生物凝膠模板的圖片Fig.4 Image of the bio-gel template after in situ synthesis

如圖4所示，原位合成納米粒子的步驟可以重復多次，從而使納米粒子粒徑增大。圖4(a)為多次原位合成Fe納米粒子后的生物凝膠模板的光學顯微鏡圖片，可以看出經過多次原位合成后，鐵納米粒子含量和粒徑均有增加，表現在生物凝膠模板呈現出3價鐵的黃色。而多次原位合成后，3價鐵并不是均勻分布的，主要集中在中心區域，如圖4(b)，中心區域由于Fe納米粒子粒徑大，含量多，導致對電子束散射大，從而呈現出陰影區域。同時采用點掃描方式對其中的1，2，3點進行Fe分布的相對強度的表征，如圖4(c)所示，可以看出2點所對應的區域Fe分布強度更大。分析其原因，可能是多次原位合成后產生的晶核的電荷吸引作用導致的。

3.4 Ag納米粒子的原位合成

如圖5所示，制作了兩層卷曲狀的三維生物凝膠模板并進行Ag納米粒子的原位合成。圖5(a)中可以看出，對于制作復雜的層狀生物凝膠模板，飛秒激光直寫具有其他方法所不可比擬的優勢［16］，可以實現這種三維復雜微結構的制作，并且在加工過程中只需要設計特定圖案的程序，無須制作昂貴、耗時的掩膜版，能夠實現生物凝膠模板制作過程的實時監控。因此，采用飛秒激光能夠快速制備生物材料光子晶體、細胞微鑷、納米針、細胞原位支架及各向異性顆粒等，從而使聚合物微結構在生物醫學領域有更大的應用潛力。此外，由于加工預聚物溶液中COOH基團的引入，使得生物凝膠模板可以與多種金屬陽離子耦合，從而形成多種納米粒子修飾的結構，并且在多次的原位合成步驟后，金屬納米粒子的粒徑和含量也可以得到控制。

在實驗中發現，由于功能組分丙烯酸的引入，使得凝膠模板在氫氧化鈉處理過程中羧酸基團互相排斥從而使整個生物凝膠模板結構膨脹度變大，有利于金屬鹽溶液的進入成核，以及納米粒子核的長大。羧酸基團使金屬陽離子在特定區域進行選擇性吸附。由于凝膠結構浸泡在鹽溶液中呈現負價態，使金屬陽離子的吸附能力進一步增強。比較圖5(c)和圖5(f)可以看出在經過多次納米粒子原位合成后，生物凝膠模板中銀的含量相對于結合位點數來說是非常高的，區域中Ag的含量達到了9%，比C含量7%還多。同時，從圖5(f)中可以看出，雙層卷曲結構的上層，由于結構懸空，相對擴散距離比束縛在襯底上的下層更小，金屬鹽溶液浸泡時，更有利于金屬納米粒子的成核與生長，因此，上層結構銀納米粒子更多，表觀黃色程度更深。圖6為圖5中上層卷曲結構的Ag分布，可以看出Ag M相和Ag Lα相相對強度最大。

圖5 三維結構的生物凝膠模板原位合成銀納米粒子的能譜儀表征((a)～(f))分別為電鏡照片，總體元素分布及 C、O、Si、Ag的分布情況Fig.5 EDS characterization after the silver nanoparticles in situ synthesis in the 3D bio-gel template.The SEM image，the total distribution of all elements and the distribution of the single element of C，O，Si and Ag

圖6 上層卷曲結構的Ag分布Fig.6 Silver distribution in the upper curl layer of the bio gel template

4 結論

本文將先進的飛秒激光直寫技術與納米粒子原位合成方法相結合，先由飛秒激光直寫出生物凝膠模板，然后用金屬鹽溶液處理凝膠模板原位合成納米粒子，制備出同時具有三維復雜形貌及特定納米粒子化學修飾的聚合物微結構。在生物凝膠模板的制作過程中，通過調節溶液組分和激光加工參數，實現在保證微結構的復雜精細程度前提下(分辨率為亞100 nm，結構大小為10 μm量級)，更多地保留功能結合位點COOH基團。此外，進行了方塊微結構Fe納米粒子和Ag納米粒子的原位合成，以及復雜的雙層卷曲結構的Ag納米粒子原位合成。多次循環原位合成納米粒子步驟后，對納米粒子聚集行為進行了分析。這種簡單高效的功能性聚合物微結構加工方法，在光子學［1］、生物醫學工程［4］、催化［19］、組織工程［3］及數據存儲等領域有廣泛的應用前景［21-24］。

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