頭穴叢刺結合豐富環境刺激對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內源性神經干細胞增殖遷移的影響

劉波，鄒偉，唐強，顏培宇

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是指在圍產期窒息缺氧等因素導致的腦部缺氧缺血性損害，而此類疾病的治療至今仍為世界性醫學難題。神經干細胞(neural stem cells,NSCs)具有高度增殖和自我更新以維持自身數目恒定的能力[1]。目前大量實驗研究表明，腦缺氧缺血后，神經再生和腦組織功能恢復的機制是由于內源性NSCs的大量增殖、遷移和分化[2-4]。本研究通過觀察頭穴叢刺結合豐富環境刺激干預對HIBD新生大鼠內源性NSCs增殖遷移的影響，探討其改善HIBD神經功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7日齡Wistar大鼠120只，由上海斯萊克公司提供，雌雄不限，體質量11～15 g。按隨機數字表法分為假手術組(A組)、造模組(B組)、頭穴叢刺組(C組)、豐富環境刺激組(D組)和頭穴叢刺結合豐富環境刺激組(E組)。每組24只，均選取3 d、7 d、14 d 3個時間點，每個時間點8只。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD動物模型。7日齡新生Wistar大鼠，吸入適量無水乙醚麻醉，暴露頸部[5]。局部碘伏消毒，做頸部正中切口，無菌分離左側頸總動脈，并用外科0號滅菌手術絲線行雙線結扎左側頸總動脈，縫合傷口。手術結束后，將動物放回原飼養環境中恢復120 min，置于自制有機玻璃缺氧箱中，保持37℃水浴恒溫，持續將體積濃度為8%氧氣和92%氮氣的混合氣體以0.5 L/min輸入缺氧箱中。術后出現平衡異常、不能翻身或夾尾左旋者視為造模成功，將其納入實驗。A組僅分離左側頸總動脈，不結扎，也不予以缺氧處理。

1.3 干預方法

A組術后置于普通母鼠籠中飼養，不予任何治療。

B組術后另置普通母鼠籠中飼養，不予任何治療。

C組采用叢刺法，按照“大鼠穴位圖譜”[6]所示，取百會穴及百會左、右側各旁開1 mm處針刺。每穴快速捻轉1 min后留針120 min，每天1次。

D組每天將幼鼠分離放入豐富環境(enriched environment,EE)籠[7]內，EE籠為70×60×50 cm的大籠，籠內放置各種質感的砂紙、毛刷，有刺激性氣味的薄荷、檸檬和冰冷的金屬，以及斜坡、轉盤、管道、秋千、蹺蹺板、小球等“玩具”。給予豐富環境干預120 min。同時配合播放舒緩的輕音，明暗紅色燈光照射。

E組予以頭穴叢刺后，將幼鼠放入EE籠中給予環境刺激120 min，拔針放回母鼠籠中。

1.4 內源性NSCs的標記[8]

將5-溴脫氧尿核苷(BrdU，美國SIGMA公司)用生理鹽水配制成5 mg/ml的溶液。各組分別于造模后24 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，每天1次，持續7 d。

1.5 免疫組化

將大鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注取腦。常規方法制成石蠟塊，應用恒冷切片機(德國LEICA)切片，片厚4μm。0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗3次，每次5 min；切片入10 g/L H2O2，室溫30 min；加入2 mol/L HCl，37℃ 45 min；切片入0.1 mol/L硼酸(pH 8.5)10 min；100 g/L正常羊血清封閉，37℃30 min；加入一抗神經巢蛋白(nestin)(1∶200，北京博奧森生物技術有限公司)、BrdU(1∶200，福州邁新生物技術開發有限公司)，4℃冰箱過夜；滴加過氧化物酶標記的抗鼠/兔IgG(MaxVionTM，福州邁新生物技術開發有限公司)，避光條件下37℃孵育60 min；DAB顯色后，進行脫水、透明、封片。選擇側腦室下帶及額葉皮層處各3張切片，每張切片光鏡下選取4個高倍視野，計陽性細胞數。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行分析。組間差異進行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BrdU陽性細胞數

BrdU陽性細胞呈棕黃色，分布于側腦室下區(SVZ)和大腦皮層等部位。B組BrdU陽性細胞數與A組同期比較明顯增加(P＜0.01)。C、D、E組BrdU陽性細胞數與B組同期比較明顯增加(P＜0.01)；E組BrdU陽性細胞數與C、D組同期比較增加(P＜0.05)。見表1。

2.2 nestin陽性細胞數

B組SVZ和大腦皮層nestin陽性細胞數與A組同期比較明顯增加(P＜0.01)；C、D、E組nestin陽性細胞數與B組同期比較明顯增加(P＜0.01)。各時間點C組、D組nestin陽性陽性細胞數相比無顯著性差異(P＞0.05)；E組nestin陽性細胞數與同期C組、D組比較明顯增加(P＜0.01)。見表2。

表1 各組Brd U陽性細胞數(/mm2)

表2 各組nestin陽性細胞數(/mm2)

3 討論

NSCs廣泛存在于哺乳動物中，產生NSCs的部位主要位于SVZ和海馬齒狀回的顆粒下區(SGZ)[9]。通常成年腦內的NSCs處于靜息狀態，在某些因素的刺激下，NSCs會被激活并增殖，在其他趨化因子的作用下向損傷部位遷移、分化[10-11]。Zhang等在實驗研究中發現，腦卒中后第2天大鼠SVZ NSCs開始增殖，第7天達到高峰，第14天時分裂細胞比例恢復至第2天水平[12]。

頭穴叢刺是于致順教授在大量的臨床經驗和科研工作的基礎上對頭穴針刺系列研究的總結與深化。其頭穴叢刺長留針可以減少日針刺數，并達到足夠有效的刺激量，克服重復針刺給患者帶來的痛苦；同時頭穴叢刺法便于與康復方法結合，以康復技術代替體針治療，以動態治療方法代替靜態治療方法，可以起到相輔相成的作用。

新生兒出生后，神經系統仍然沒有發育成熟，神經細胞和突觸數量持續增加，直至2歲左右達到一個穩定的水平。在此期間，中樞神經系統可塑性極強，不斷發生神經再生、分化、凋亡以及神經元軸突的生長、剪切、髓鞘形成等過程。這可能是早期康復干預可行性的生物學基礎。近年來利用環境康復療法治療發育期腦損傷日益得到人們的重視。臨床研究也證實，發育早期豐富環境干預有利于腦發育和腦功能的發揮，豐富環境刺激可增強中樞神經系統的突觸可塑性，促進腦發育和腦損傷的修復[13]。環境康復療法有望成為臨床治療HIBD及減輕腦損傷后遺癥的經濟、無創、無痛苦的有效方法。

大量的實驗研究表明，針刺和豐富環境刺激對內源性NSCs的增殖分化后的神經功能恢復都有重要作用。唐強等電針取穴曲池和足三里，觀察針刺對腦缺血再灌注大鼠內源性NSCs增殖及遷移的影響，發現電針法能夠促進與增殖和遷移有關的細胞因子表達，改善NSCs增殖、遷移的微環境，促進NSCs分化[14]。Komitova等實驗發現，與未接受豐富環境刺激組比較，豐富環境可以促進腦缺血大鼠SVZ NSCs的增殖[15]。而我們在前期的實驗中證實，腦缺氧缺血后，頭穴叢刺結合環境刺激可促進海馬微管相關蛋白-2和突觸素的陽性表達[5]。早期給予頭穴叢刺和豐富環境刺激干預，可以明顯改善HIBD新生大鼠學習記憶能力，甚至可能使學習記憶功能恢復到正常水平[16-17]。

本實驗顯示，頭穴叢刺結合豐富環境刺激可促進HIBD新生大鼠內源性NSCs的增殖、遷移，明顯優于單純頭穴叢刺或豐富環境刺激，這可能是頭穴叢刺結合環境刺激促進腦缺氧缺血后神經功能恢復的機制之一。

[1]鄭修元,李勝活,燕鐵斌.腦梗死與內源性神經干細胞[J].中國康復醫學雜志,2011,26(8):783-787.

[2]陳光福,張蘊芳,龍琦,等.早期干預對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內源性神經干細胞增殖的影響[J].實用兒科臨床雜志,2011,26(20):1575-1577.

[3]Shen CC,Yang YC,Chiao MT,et al.Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke[J].Curr Neurovasc Res,2010,7(1):6-14.

[4]陳光福,張蘊芳,龍琦,等.豐富環境干預促進缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經元細胞增殖和功能修復[J].中國當代兒科雜志,2012,14(2):139-143.

[5]劉波,唐強,邢艷麗,等.頭穴叢刺結合環境刺激對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬微管相關蛋白-2和p38表達影響的實驗研究[J].針灸臨床雜志,2011,27(2):63-66.

[6]華興邦.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,(1):1-5.

[7]Rosenberg AA,Muydaugh E.The effect of blood glucose concentration on post asphyxia cerebral hemodynamics in newborn lambs[J].Pediatr Res,1990,27(5):454.

[8]張紅星,張曉艷,周利,等.頭針對腦缺血再灌注大鼠內源性神經干細胞增殖及遷移的影響[J].中國中西醫結合雜志,2011,31(7):951-954.

[9]Whitman MC,Greer CA.Adult neurogenesis and the olfactory system[J].Prog Neurobiol,2009,89(2):162-175.

[10]Chu K,Kim M,Chae SH,et al.Distribution and in situ proliferation patterns of intravenously injected immortalized human neural stem-like cells in rats with focal cerebral ischemia[J].Neuroscience Res,2004,50(4):459-465.

[11]張小喬,李鸝,馬國平,等.重復經顱磁刺激對腦梗死大鼠梗死側皮質內源性神經干細胞激活、增殖的影響[J].卒中與神經疾病,2012,19(2):76-79.

[12]Zhang RL,Zhang ZG,Roberts C,et al.Lengthening the G(1)phase of neural progenitor cells is concurrent with an increase of symmetric neuron generating division after stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(3):602-611.

[13]Pham TM,Winblad B,Granholm AC,et al.Environmental influences on brain neurotrophins in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2002,73(1):167-175.

[14]唐強,徐志華,白晶.電針對大鼠腦梗死后內源性神經干細胞增殖遷移的影響[J].針灸臨床雜志,2008,24(8):49-51.

[15]Komitova M,Mattsson B,Johansson BB,et al.Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats[J].Stroke,2005,36(6):1278-1282.

[16]劉波,鄒偉,孔妍.頭穴叢刺結合環境刺激對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后學習記憶能力影響的實驗研究[J].中醫藥信息,2013,30(1):78-83.

[17]劉波,張鴻婷,唐強.針刺結合環境刺激治療缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的實驗研究進展[J].中國康復理論與實踐,2009,15(3):216-217.