合歡花黃酮對精神分裂癥模型大鼠學習能力的影響及其機制研究①

杜志敏 馬 倩 宋予娟 呂路線 齊 鵬 李萬里 (新鄉醫學院免疫教研室，新鄉453003)

精神分裂癥是臨床上較為常見的危害人體健康的疾病。該病多發生于青壯年，常伴有感知、情感、思維、行為等方面的障礙，一般無意識和智能障礙，可伴有記憶、信息整合和抽象思維等損害，是一組病因不明的癥狀與體征的集合[1]。精神分裂癥不僅嚴重影響了患者及其家屬的工作和生活，而且也給患者及家庭、社會帶來沉重的負擔。

合歡花中含有多糖、多酚、黃酮等多種活性成分，經研究顯示，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化自由基、抗菌、鎮靜、消炎、提高免疫力、調節血管滲透性等作用，最近研究發現黃酮類化合物對神經精神系統有顯著的影響，例如神經保護、中樞抑制、抗抑郁、抗焦慮等作用[2]。合歡花黃酮的藥理作用多，價格低，且安全劑量大，毒副作用小，因此成為神經精神系統研究領域的熱點。

目前非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽(Dizocilpine maleate，MK-801)已經廣泛應用于制作精神分裂癥動物模型。該藥物可使實驗動物表現出精神分裂癥的一些陽性、陰性癥狀以及認知功能的損害[3]。本實驗采用MK-801制備大鼠模型，使用合歡花黃酮對模型進行干預，觀察模型的學習認知能力的變化，并且檢測其對模型大鼠海馬組織中精神疾病相關蛋白S100-β、c-Fos表達的影響，探討其干預精神分裂癥的分子機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重190～220 g，河北省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(冀)2008-1-003。飼養溫度為20～26℃之間，濕度保持在50% ～60%，定期清洗消毒。

1.2 實驗主要試劑 MK-801(美國Sigma公司)，兔抗大鼠S100-β、c-Fos多克隆抗體(武漢博士德公司)，SP試劑盒 SP9001、FITC標記山羊抗兔 IgG(H+L)、β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 合歡花黃酮的提取 稱取粉碎后的合歡花粉末購買于新鄉市張仲景大藥房，包好置于索氏提取器內，用石油醚加熱回流脫脂6 h，此時抽提液呈無色，50%乙醇浸提2 h，浸提溫度70℃，浸提2次。提取液抽濾，取濾液測定黃酮含量[4]。黃酮提取率(%)=，式中:c為量黃酮質量濃度(mg/ml);v為提取液體積ml;N為樣品稀釋倍數;m為未脫脂前原料的質量g。

1.4 實驗分組 SD大鼠，單籠適應性飼養環境5天后，隨機分為四組，每組10只，分別為正常組(Control)、模型組(Model)、氟哌啶醇陽性對照組(HLA)、合歡花黃酮干預組(FAF)。

1.5 模型構建及干預 Control組與Model組灌胃生理鹽水，HLA組灌胃氟哌啶醇(劑量:2 mg/kg)，FAF組灌胃合歡花黃酮(劑量:60 mg/kg)單位體重給藥容量100 μl/20 g，1 次/d，連續給 28 d 后，Model組、HLA組、FAF組按照100 μl/20 g的單位體重給藥容量分別于右后側腹腔注射0.6 mg/kg MK-801，Control組腹腔注射等體積生理鹽水，均連續注射3 d建立模型[5]。于第4天進行Morris水迷宮實驗，評價模型是否成功的標準:以Control組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，計算每只大鼠的平均逃避潛伏期值與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值 ＞20%則表示造模成功[6，7]，根據實驗數據分析評定，Model組10只大鼠均造模成功，提示MK-801阻斷NMDA受體成功。建模過程中未出現動物死亡。根據實驗觀察所有大鼠采用同樣的測試順序，實驗直至結束均采用雙盲測試。

1.6 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮可通過對大鼠進行定位航行(大鼠逃避實驗)和空間探索實驗來判斷其學習記憶能力，用大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數來表示。對Control組、Model組、氟哌啶醇組(HLA)、合歡花黃酮組(FAF)造模后大鼠行水迷宮測試。采用諾達思(北京)信息技術公司研制開發的Morris水迷宮視頻分析系統進行信息處理，該系統能動態記錄大鼠在水迷宮中游泳的錄像資料，設定分析參數，進行數據分析。定位航行實驗:于給藥結束1 d后進行，實驗前將大鼠置于站臺上適應30 s，隨后將大鼠隨機四個象限面壁置入池內，大鼠登上站臺5 s后終止記錄，最長記錄時間為60 s，若大鼠在60 s內不能上臺，引導其登上站臺適應30 s，最后將大鼠擦干放入鼠籠，4次/d，每次間隔1 h，定位航行訓練需要4 d。空間探索實驗:于第5 d進行，實驗時撤去液面下站臺，大鼠于四個象限入水點面壁入水，讓其自由游泳60 s，測量大鼠在目標象限穿越平臺次數。

1.7 免疫組化 水迷宮實驗結束24 h后，4%多聚甲醛10 ml/min灌注取出海馬組織。取其左側海馬組織置于多聚甲醛中固定24 h，再分別放入10%、20%、30%蔗糖PBS液中4℃冰箱過夜至沉底。經過沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制作7 μm石蠟切片(冠狀位切取海馬)。石蠟切片經過熔蠟、脫蠟水化、抗原修復、破膜、封閉、S100-β、c-Fos一抗孵育、清洗、生物素標記的二抗孵育、清洗、DAB顯色等步驟后，在顯微鏡下觀察各組大鼠海馬細胞中S100-β、c-Fos蛋白的分布和表達變化情況。

1.8 免疫熒光 石蠟切片經過熔蠟、脫蠟水化、抗原修復、破膜、封閉、S100-β、c-Fos一抗孵育、清洗、FITC標記的二抗孵育、清洗、復染DAPI、封片等步驟后，在熒光顯微鏡下觀察各組大鼠海馬細胞中S100-β、c-Fos蛋白的分布和表達變化情況。

1.9 免疫印跡(Western blot) 水迷宮實驗結束24 h后，4%多聚甲醛10 ml/min灌注取出右側海馬，先液氮保存，再凍存于-80℃冰箱保存備用。取出腦組織加入預冷的細胞裂解液，經過研磨制成勻漿液，冰浴 30 min，15 000 r/min，4℃離心 30 min，取上清至EP管中。BCA試劑盒定量蛋白，每組蛋白上樣量30 μg，經過SDS-PAGE 電泳，轉膜，一抗孵育，二抗孵育后，ECL發光并且X膠片曝光。所得的膠片結果經掃描后，利用Quantity One凝膠成像分析系統分析條帶并記錄灰度值結果，并與內參β-actin的灰度值相比較得出相對灰度值結果。

2.10 統計學分析 應用SPSS18.0統計軟件分析，數據均經方差齊性檢驗，以x-±s標準差形式表示，多個樣本均數比較采用One-way ANOVA檢驗，水迷宮實驗數據采用重復測量數據方差分析，組間及組內兩兩比較用 LSD-t檢驗或 Dunnett’s檢驗，P＜0.05為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 水迷宮測試結果 4組大鼠4 d尋找目標象限時間(逃避潛伏期，Escape latency，EL)比較顯示:Control組大鼠的逃避潛伏期最短，學習記憶能力最強;與Control組比較，Model組、HLA組、FAF組EL均延長，HLA組、FAF組大劑量大鼠的EL較Model組大鼠明顯縮短，差異有統計學意義(P＜0.05 or P＜0.01);HLA組、FAF組大鼠的EL差異無統計學意義(P＞0.05);4組大鼠第5 d穿越平臺次數(Views across platforms，VAP)比較顯示:Control組大鼠VAP最多，空間記憶能力最強;與Control組比較，Model組、HLA組、FAF組大鼠 VAP均減少，HLA組、FAF組大鼠較Model組大鼠VAP明顯增多，差異有統計學意義(P＜0.01);HLA組、FAF組大鼠VAP差異無統計學意義(P＞0.05)。水迷宮測試結果顯示:HLA組、FAF組大鼠的學習記憶能力明顯改善(圖1和2)。

2.2 免疫組化檢測大鼠海馬組織中S100-β、c-Fos蛋白的表達 免疫組化結果顯示Control組僅見少量S100-β、c-Fos免疫組化陽性細胞，細胞著色較淺;Model組，S100-β、c-Fos蛋白表達較多，細胞著色較深，顆粒增粗，與Control組相比差異有統計學意義(P ＜0.01);HLA 組、FAF 組 S100-β、c-Fos陽性細胞表達較Model組有所減少，同時細胞著色較Model組淺，差異有統計學意義(P＜0.01);HLA組與FAF組之間S100-β、c-Fos陽性細胞表達差異無統計學意義 (P＞0.05)(圖3和4)。

圖1 大鼠逃避實驗Fig．1 Escape latency experiments in rats

圖2 大鼠穿越平臺實驗Fig．2 Experimental of views across platforms in rats

圖3 海馬組織中S100-β蛋白的表達分析Fig．3 The expression of S100-β in hippocampal tissue

圖4 海馬組織中c-Fos蛋白的表達分析Fig．4 The expression of c-Fos protein in hippocampal tissue

圖5 S100-β蛋白的表達Fig．5 Expression of S100-β protein

圖6 c-Fos蛋白的表達Fig．6 Expression of c-Fos protein

2.3 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中S100-β、c-Fos蛋白的表達 免疫熒光的結果顯示Control組綠色熒光細胞數明顯少于Model組，差異有統計學意義(P＜0.01)。HLA組、FAF組海馬中可見綠色熒光，但與Model組相比，細胞數減少，熒光較弱，差異有統計學意義(P＜0.01)。HLA組、FAF組之間差異無統計學意義(P＞0.05)(圖5和6)。

2.4 Western blot檢測腦組織S100-β、c-Fos蛋白的表達 Western blot結果顯示:Control組中S100-β、c-Fos蛋白表達處于較低水平，Model組中S100-β、c-Fos蛋白表達水平較Control組均明顯升高，差異有統計學意義(P ＜0.01);HLA組、FAF組中S100-β、c-Fos蛋白表達較Model組有所降低，差異具有統計學意義(P＜0.01);HLA組、FAF組中S100-β、c-Fos蛋白表達未見明顯差異，無統計學意義(P＞0.05)(圖7)。

圖 7 S100-β、c-Fos蛋白的表達Fig．7 The expression of S100-β，c-Fos protein in brain tissue

3 討論

關于精神分裂癥的發病機制有三大假說:多巴胺功能亢進假說、5-羥色胺功能紊亂假說和谷氨酸功能低下假說。與精神分裂癥發病的三大假說相對應，有三大類擬精神病藥物用于制作精神分裂癥動物模型:多巴胺受體激動劑、5-羥色胺受體激動劑、谷氨酸受體拮抗劑。谷氨酸受體拮抗劑如地卓西平馬來酸鹽(MK-801)能很好地模擬精神分裂癥的陽性癥狀、陰性癥狀和認知功能障礙三大癥狀，因此至今為止MK-801仍是精神病藥物篩選的首選模型[8]。研究表明，小劑量MK-801破壞了大鼠的參照記憶、空間工作記憶和逆反學習，從而能夠在多個認知維度上模擬精神分裂癥患者的認知缺陷[9]。本實驗就采用MK-801作為精神分裂癥的誘導劑來構建大鼠精神分裂癥模型。在水迷宮實驗中，模型組大鼠表現出了較低的空間參考記憶，而合歡花黃酮干預后改善了這些認知能力，提示合歡花黃酮能夠有效改善大鼠精神分裂癥的認知缺陷。

S100-β是一種鈣結合蛋白，已被作為活化的膠質細胞和腦功能障礙的標志物。S100-β在血清和腦脊液中的濃度變化可以靈敏地反映中樞損害的程度，故可作為判斷和定量評估輕微腦損害程度的特異指標[10]。凌四海等[11]研究發現精神分裂癥患者血漿中S100-β濃度明顯升高，且患者精神癥狀越嚴重，其血漿中S100-β濃度越高。c-Fos蛋白是即刻早期基因c-Fos的神經元激活后快速轉錄的產物。正常情況下，在絕大多數神經元中c-Fos蛋白呈現低水平表達，不易檢測到。但在外界刺激導致腦損傷時，海馬及皮層短時內即可出現c-Fos的激活和過表達[12]。Nowak 等[13]通過利用地卓西平馬來酸鹽(MK-801)制備大鼠模型，使其產生精神分裂癥樣癥狀，采用免疫組化的方法檢測到在內側前額葉皮質層下發現c-Fos的表達顯著增加。本研究中發現，S100-β和c-Fos在精神分裂癥模型大鼠海馬組織中表達增多，而合歡花黃酮能夠明顯降低這兩種蛋白的表達。由于S100-β和c-Fos與精神分裂癥有著密切的關系，而合歡花黃酮能夠降低其表達，因此合歡花黃酮很可能是改變這兩種蛋白的表達而改善了精神分裂癥的癥狀。

綜上所述，合歡花黃酮具有一定的神經保護作用，能改善精神分裂大鼠的認知缺陷，并且其作用可能與精神分裂癥大鼠海馬組織中的S100-β、c-Fos表達下調有關。

[1]回秀清，王學義.精神分裂癥認知功能損害特點及干預研究進展[J].神經疾病與精神衛生，2011，11(1):69-72.

[2]馬 銳，吳勝本.中藥黃酮類化合物藥理作用及作用機制研究進展[J].中國藥物警戒，2013，10(5):286-290.

[3]司天梅，舒 良.地卓西平馬來酸鹽動物行為模型研究[J].中華精神科雜志，2000，33(3):158-160.

[4]袁建梅，郭偉云，汪應靈.合歡花中總黃酮的提取工藝及對羥自由基清除作用的研究[J].中國食品添加劑，2012，(1):87-91.

[5]Sams-Dodd F.Phencyclidine-induced stereotyped behaviour and social isolation in rats:a possible animal model of schizophrenia[J].Behavioural pharmacology，1996，7(1):3-23.

[6]冀俊虎，董聯玲，曹 娟，等.紅景天對阿爾茨海默病大鼠行為學和腦組織抗氧化能力的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2009，16(2):38-38.

[7]Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nature protocols，2006，1(2):848-858.

[8]楊 闖，郭蘭婷，郭田友.谷氨酸受體與精神分裂癥[J].中國神經精神疾病雜志，2005，31(3):3-3.

[9]李繼濤，蘇允愛，楊 陽，等.小劑量 MK-801對大鼠參照記憶，空間工作記憶和逆反學習能力的影響[J].中國神經精神疾病雜志，2011，37(5):261-265.

[10]Chan MK，Guest PC，Levin Y，et al.Converging evidence of blood-based biomarkers for schizophrenia:an update[J].Int Rev Neurobiol，2011，101:95-144.

[11]凌四海，郭實士，楊鐵生，等.精神分裂癥患者血中 S100b蛋白和抗腦抗體的研究[J].中國神經精神疾病雜志，2005，31(004):278-281.

[12]Simjee SU，Shaheen F，Choudhary MI，et al.Suppression of c-Fos protein and mRNA expression in pentylenetetrazole-induced kindled mouse brain by isoxylitones[J].J Mol Neurosci，2012，47(3):559-570.

[13]Nowak K，Meyza K，Nikolaev E，et al.Local blockade of NMDA receptors in the rat prefrontal cortex increases c-Fos expression in multiple subcortical regions[J].Acta Neurobiol Exp，2012，72:207-218.