姜黃素下調胸腺基質淋巴細胞生成素表達及功能的研究①

高明春 郝成欣 高志玲 劉大偉 高曉霞 (吉林省白城醫學高等?？茖W校，白城137000)

特應性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復發性炎癥性皮膚病，主要表現為劇烈的瘙癢、明顯的濕疹樣變和皮膚干燥[1]，其發生發展過程涉及多種細胞，如肥大細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、嗜酸性粒細胞及T細胞等。近年來，隨著對特應性皮炎直接相關的效應細胞及效應分子研究的深入，逐步明確肥大細胞在特應性皮炎炎癥過程中遷移、聚集、局部數量增多的機制[2]。眾多研究表明，在AD動物模型中，大量肥大細胞被激活并浸潤到皮膚破損處，從而表明了肥大細胞在AD中的作用[3]。肥大細胞的激活能產生大量的胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)。研究證明，特應性皮炎患者皮損處的角質形成細胞高度表達TSLP[4]。此外，TSLP還能顯著提高 CD11c+樹突狀細胞的成熟，從而促進幼稚CD4+T細胞朝Th2細胞的分化，增強皮膚或全身的Th2反應[5]。由于上述過程均與炎癥反應密切相關，而大量的研究報道稱姜黃素具有抗炎及抗氧化活性[6，7]。因此，本研究主要觀察姜黃素在肥大細胞系HMC-1細胞中對TSLP表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗試劑 人肥大細胞系HMC-1購自于廣州吉妮歐生物科技有限公司。細胞培養采用含10%胎牛血清的IMDM(美國Gibco公司)培養基(內含100 U/ml的青霉素和鏈霉素)。佛波酯(PMA)，A23187及姜黃素購自 Sigma公司。Caspase-1活性檢測試劑盒購自 R＆D公司。人TSLP抗體、NF-κB p65抗體及細胞核蛋白抽提試劑盒購自于碧云天公司。

1.2 TSLP的ELISA檢測 以每孔4×105個HMC-1細胞密度鋪板，37℃、5%CO2孵箱培養過夜，經0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187刺激7 h，離心收集上清液，采用夾心ELISA方法來檢測培養上清液中的TSLP水平。詳細步驟可參照說明書。

1.3 TSLP mRNA的定量RT-PCR檢測 以每孔1×106個HMC-1細胞密度鋪板，培養過夜，經0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187僅刺激5 h(mRNA表達高峰比蛋白出現早)，收集細胞并采用qRT-PCR法來檢測TSLP mRNA的表達。采用Trizol試劑(Invitrogen公司)來提取收集的各組HMC-1細胞中的總RNA，并逆轉錄獲得cDNA(TaKaRa公司)。采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)對TSLP mRNA表達情況進行檢測，β-actin作為內參。引物均為上海生物工程有限公司合成，序列如下:人TSLP(上游5'-TGGGTGTCCACGTATGTTCC-3';下游5'-CGGTACTTTTGGTCCCACTCA-3')及人 β-actin(上游 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3';下游5'-CCTTCTGCATCTGTCGGCA-3')，擴增產物大小分別為197 bp和275 bp。利用ABI PRISM7300快速實時PCR系統進行PCR反應:先預變性95℃ 30 s，然后以95℃ 5 s，60℃ 31 s的條件進行40個PCR循環反應。采用2-△△Ct法對TSLP mRNA的相對表達量進行計算。

1.4 NF-κB p65的Western blot檢測 與ELISA 檢測TSLP蛋白刺激方法相同，收集各組HMC-1細胞，用細胞核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，蛋白濃度采用Bradford方法測定，蛋白行12%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉移到PVDF膜上 (北京鼎國生物技術有限公司)，以含有5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h后，兔抗人 NF-κB p65 一抗(1∶1 000)孵育 4℃ 過夜，二抗(羊抗兔1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影(碧云天生物技術有限公司)，曝光。以β-actin作為內參。應用Bio-Rad成像系統對條帶進行灰度掃描，半定量分析細胞核內NF-κB p65的表達水平，從而來反映各組NF-κB的活化情況。

1.5 caspase-1活性的檢測 以每孔5×106個HMC-1細胞密度鋪板，37℃、5%CO2孵箱培養過夜，經0.5～5 μmol/L濃度的姜黃素刺激2 h后，加入PMA與A23187刺激1 h，最后離心收集細胞。采用caspase-1活性檢測試劑盒進行檢測，按照說明書操作。主要過程是向收集的細胞中加入冷的裂解緩沖液，冰上裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清。然后在每個裂解上清中加入80 μl的檢測緩沖液及10 μl的 Ac-YVAD-pNA，37℃下孵育 2 h，最后測定A405值。

1.6 統計學分析 實驗數據均采用SPSS16.0軟件進行統計分析，實驗數據采用±s表示，組間比較采用T檢驗和方差分析，P＜0.05為組間有顯著性差異。

2 結果

2.1 姜黃素對HMC-1細胞中TSLP因子表達的影響 通過ELISA方法檢測刺激上清液中的TSLP，結果發現PMA聯合A23187能刺激HMC-1細胞中TSLP表達的上調。而不同濃度的姜黃素均能在一定程度上降低由PMA和A23187誘導的TSLP水平，尤其以50 μmol/L姜黃素最為顯著(見圖1，P＜0.05)，最大的抑制率能達到(29.5±5.3%)。

2.2 姜黃素對HMC-1細胞中TSLP mRNA表達的影響 通過定量RT-PCR的方法分析TSLP mRNA的表達，結果發現PMA聯合A23187能刺激TSLP mRNA表達的上調。而不同濃度的姜黃素均能在一定程度上降低由PMA和A23187誘導的TSLP mRNA水平(圖2)，且50 μmol/L姜黃素的抑制效果大于0.5和5 μmol/L(P ＜0.05)。

2.3 姜黃素對HMC-1細胞中NF-κB p65活化的影響 通過Western blot來檢測細胞核中NF-κB p65的表達情況，以此來反映姜黃素對NF-κB p65活化情況的影響。結果如圖3所示，PMA聯合A23187能增加NF-κB p65在細胞核內的表達，激活HMC-1細胞中NF-κB活性;而在50 μmol/L姜黃素的作用下，卻降低因 PMA加 A23187誘導的核內 NF-κB p65的表達，從而抑制NF-κB活性(P＜0.05)。

2.4 姜黃素對HMC-1細胞中caspase-1活性的影響 caspase-1活性實驗結果如圖4所示，PMA聯合A23187能在HMC-1細胞中活化caspase-1，然而，在50 μmol/L姜黃素的作用下，卻顯著地抑制因PMA加A23187誘導的caspase-1活化(P＜0.05)。

圖1 姜黃素對HMC-1細胞TSLP表達的影響Fig．1 Effects of curcumin on the production expression of TSLP in HMC-1 cells

圖2 姜黃素對HMC-1細胞TSLP mRNA表達的影響Fig．2 Effects of curcumin on the expression of TSLP mRNA in HMC-1 cells

圖3 姜黃素對HMC-1細胞NF-κB活化的影響Fig．3 Effects of curcumin on the activation of NF-κB in HMC-1 cells

3 討論

姜黃素是一種天然化合物，是我國傳統中藥姜黃根莖中的天然有效成份，現已證明具有一定的抗炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等活性。本研究主要探討天然化合物姜黃素對胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)表達的影響。

圖4 姜黃素在HMC-1細胞中對caspase-1活化的影響Fig．4 Effects of curcumin on the activation of caspase-1 in HMC-1 cells

PKC激活劑PMA一般是甘油二酯的替代物，而A23187則是一種廣泛被使用的離子載體。相關研究表明，PMA聯合A23187能刺激TSLP的產生[8]。此外，在特應性皮炎患者皮損處也存在TSLP的高表達[4]。在本研究中，通過ELISA和RT-PCR方法結果證實了姜黃素在蛋白及mRNA水平上均能顯著地抑制由PMA與A23187誘導的TSLP表達。因此，我們推測姜黃素對TSLP升高引發的特應性皮炎等疾病有潛在的治療作用。

NF-κB是一種調節參與免疫反應及炎癥反應基因表達的轉錄因子。據報道，在各種細胞中如成纖維細胞、上皮細胞及肥大細胞中，人TSLP mRNA的表達均受控于 NF-κB[7，8]。Rafiee 等[9]研究發現姜黃素在酸化的HET-1A細胞中能抑制NF-κB的活化，此外，姜黃素還能在小鼠體內抑制NF-κB的結合能力[10]。同時，本研究發現姜黃素能抑制NF-κB p65在肥大細胞核內的表達，以此來反映姜黃素抑制 NF-κB 的活性。Kouzaki等[11]報道，蛋白酶能通過蛋白酶激活受體2(PAR-2)來誘導TSLP產生，因此，我們推測姜黃素抑制TSLP的表達，不僅是通過NF-κB途徑，可能還與其他機制相關，如PAR-2。

Caspase-1能被多種前炎癥刺激物所激活。本研究發現在前炎癥刺激物(PMA及A23187)的刺激下，HMC-1細胞的caspase-1的活性顯著增加。有相關研究報道，TSLP的表達和產生與caspase-1活性相關[7]。而本研究發現，在姜黃素的作用下可以抑制因前炎癥刺激物誘導的caspase-1活性。因此，推測姜黃素抑制肥大細胞TSLP的表達和產生，可能是通過阻斷caspase-1活性來實現的。

綜上所述，本研究揭示了姜黃素能在肥大細胞中抑制由PMA聯合A23187所誘導的炎癥反應，其機制與阻斷caspase-1及NF-κB的活性抑制TSLP的表達相關，提示著姜黃素在炎癥治療中有著潛在的應用前景。

[1]Choi JK，Kim SH.Rutin suppresses atopic dermatitis and allergic contact dermatitis[J].Exp Biol Med(Maywood)，2013，238(4):410-407.

[2]Liu FT，Goodarzi H，Chen HY.IgE，mast cells，and eosinophils in atopic dermatitis[J].Clin Rev Allergy Immunol，2011，41(3):298-310.

[3]Hong SW，Kim MR，Lee EY，et al.Extracellular vesicles derived from Staphylococcus aureus induce atopic dermatitis-like skin inflammation[J].Allergy，2011，66(3):351-359.

[4]Reefer AJ，Hulse KE，Lannigan JA，et al.Flow cytometry imaging identifies rare TH2 cells expressing thymic stromal lymphopoietin receptor in a“proallergic”milieu[J].J Allergy Clin Immunol，2010，126(5):1049-1058.

[5]Wang WL，Li HY，Zhang MS，et al.Thymic stromal lymphopoietin:a promising therapeutic target for allergic diseases[J].Int Arch Allergy Immunol，2013，160(1):18-26.

[6]El-Moselhy MA，Taye A，Sharkawi SS，et al.The antihyperglycemic effect of curcumin in high fat diet fed rats.Role of TNF-α and free fatty acids[J].Food Chem Toxicol，2011，49(5):1129-1140.

[7]Liao S，Xia J，Chen Z，et al.Inhibitory effect of curcumin on oral carcinoma CAL-27 cells via suppression of Notch-1 and NF-κB signaling pathways[J].J Cell Biochem，2011，112(4):1055-1065.

[8]Moon PD，Kim HM.Thymic stromal lymphopoietin is expressed and produced by caspase-1/NF-κB pathway in mast cells[J].Cytokine，2011，54(3):239-243.

[9]Rafiee P，Nelson VM，Manley S，et al.Effect of curcumin on acidic pH-induced expression of IL-6 and IL-8 in human esophageal epithelial cells(HET-1A):role of PKC，MAPKs，and NF-kappaB[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009，296(2):G388-398.

[10]Wakade C，King MD，Laird MD，et al.Curcumin attenuates vascular inflammation and cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in mice[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(1):35-45.

[11]Kouzaki H，O'Grady SM，Lawrence CB，et al.Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2 [J].J Immunol，2009，183(2):1427-1434.