NK細胞的發(fā)育分化與功能極化①

魏海明 田志剛

(中國科學技術大學免疫學研究所，合肥230027)

魏海明(1963年－)，中國科學技術大學生命科學學院教授、博士生導師，中國免疫學會理事、中國免疫學會基礎免疫學專業(yè)委員會副主任委員，中國免疫學會腫瘤免疫與生物治療專業(yè)委員會副主任委員，中國免疫學會英文會刊Cellular＆Molecular Immunology編輯部主任。主要從事天然免疫與腫瘤免疫研究，近五年來以通訊作者在PNAS、Nat Commun、Hepatology、Gastroenterology、PLoS Pathog、J Autoimmun、J Immunol等SCI收錄的國外雜志發(fā)表論文16篇，以署名作者發(fā)表SCI論文55篇。

田志剛(1956年－)，中國科學技術大學生命科學學院教授、博士生導師，現(xiàn)任中國科技大學生命科學學院院長，免疫學研究所所長。中國免疫學會副理事長，中國免疫學會英文會刊(Cell Mol Immunol)執(zhí)行主編。2001年國家杰出青年獲得者、2007年教育部創(chuàng)新團隊負責人、2008和2011年國家基金委《天然免疫與重大疾病發(fā)生發(fā)展》創(chuàng)新群體負責人。2008年國家自然科學二等獎(首位)、2011年國家科技進步二等獎(第二位)。主要從事天然免疫和肝臟免疫學研究，以通訊作者在 Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nature Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol、J Immunol等SCI收錄的國外雜志發(fā)表論文159篇，Web of Science他引2 415次，在美、德、加、日等國際會議或訪問中作學術報告30余次。

近十年來，NK細胞的研究有兩大重要進展，一是發(fā)現(xiàn)NK細胞的受體多樣性，二是發(fā)現(xiàn)NK細胞的功能多樣性［1，2］。NK細胞受體主要由兩個基因復合體集中編碼，分別是人第19號染色體上的白細胞受體復合體 (Leukocyte receptor complex，LRC)和第12號染色體上的NK細胞受體復合體(NK receptor complex，NKC)，至少編碼10種以上抑制性受體和20種以上活化性受體、黏附分子和共刺激分子，NK細胞的這種受體多樣性是生物多樣性的微觀體現(xiàn)，也是生物多樣性的代表性范例，最終賦予NK細胞的功能多樣性。NK細胞的專職功能一直被認為是抗病毒、殺腫瘤，但最近在多種組織或器官中發(fā)現(xiàn)不同比例的居留NK細胞，可以表現(xiàn)出多樣性功能［3，4］，比如，肝臟 NK 細胞可能介導肝臟免疫耐受或免疫損傷，蛻膜NK細胞可能介導母胎免疫耐受或血管重鑄，腫瘤浸潤NK細胞(TINK)可能介導腫瘤免疫逃逸或直接殺傷。

NK細胞受體多樣性和功能多樣性的產(chǎn)生與NK細胞的發(fā)育分化密不可分，CD34+造血干細胞在向NK細胞發(fā)育分化過程中，通過生理微環(huán)境提供的 SCF、Flt3-L、IL-7、IL-15等多種細胞因子的作用，逐漸表達各種活化性受體與抑制性受體，進一步接受多種配體的作用，當機體出現(xiàn)病理變化，需要NK細胞發(fā)揮功能效應時，NK細胞向病理微環(huán)境定向趨化，在此進程中持續(xù)性、進行性獲得局部炎性因子的觸發(fā)和誘導，發(fā)生程序性分化和增殖，并最終極化為 NKtolerant、NKcytotoxic、NKregulatory等不同功能狀態(tài)的NK細胞。以下就NK細胞的發(fā)育分化和功能極化過程及機制做初步概述。

1 NK細胞的發(fā)育分化過程初見端倪

NK細胞主要從造血干細胞(CD34+HSC)發(fā)育分化而來，其過程可分為三個階段，以出現(xiàn)NK前體細胞(NKP)、未成熟NK細胞(iNK)和形成有功能的成熟NK細胞(mNK)為標志。整個過程依賴于骨髓基質微環(huán)境，因為后者可以提供NK發(fā)育分化必需的多種細胞因子。首先，在早期造血生長因子如FLT-3配基和c-kit配基(即干細胞因子SCF)等的作用下，CD34+HSC上調(diào)IL-2/IL-15Rβ(CD122)的表達，逐漸分化為CD34+CD122+CD56－NKP;這些前體細胞通過CD122分子獲得對IL-15的應答能力。在骨髓微環(huán)境中IL-15主要由骨髓基質細胞產(chǎn)生，對NK細胞發(fā)育成熟起關鍵作用，最終可促進CD56 的表達，形成 CD3－CD56+NK 細胞［5］。

NK細胞還可以從淋巴結和扁桃體等次級淋巴組織(SLT)中發(fā)育成熟。其中主要是CD56brightNK細胞亞群，而CD56dimNK細胞可在淋巴結發(fā)育，但隨輸出淋巴管遷移出來，主要存在于外周血中。在SLT 中含有 CD34+CD45RA+α4β7+c-kit+CD2+CD7－CD62L+CD25+CD10－前體細胞，能夠發(fā)育成為 CD56brightCD16dim/－NK 細胞［6］。在腸道的黏膜相關淋巴組織中也有CD34+CD45RA+NK前體細胞存在［7］，并伴隨有大量能夠產(chǎn)生IL-15的DC或其他APCs的存在。用抗體阻斷CD56分子與成纖維細胞生長因子受體1(FGFR-1)的相互作用，能夠明顯抑制CD56brightNK細胞轉化成CD56dimNK細胞，說明CD56分子對促進NK細胞的終末分化起到重要作用［8］。除了以上提到的骨髓、淋巴結和小腸等，NK細胞還可能會從肝臟、脾臟、胸腺(胸腺早期淋巴樣前體細胞ELP也可分化發(fā)育成NK細胞)等環(huán)境中發(fā)育而來。

NK細胞在完成發(fā)育分化、履行自身功能之前，還要經(jīng)歷一個受教育(Educated)和被致敏(Primed)即獲能的過程。先是NK以其抑制性受體與“實施教育”的同一個體(因而遺傳背景相同)的正常細胞表面的MHCⅠ類分子相互識別，使之獲得對自身細胞的免疫耐受，然后表達諸多能識別環(huán)境中細胞因子的受體，并接受相應細胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和Ⅰ型干擾素的刺激，而成為能顯示功能的致敏NK細胞(Primed NK)或特許NK細胞(Licensed NK)，當這些細胞與靶細胞相遇，即可通過整合抑制性和活化性信號，確定是否對靶細胞進行殺傷、耐受，還是進一步產(chǎn)生細胞因子發(fā)揮調(diào)節(jié)功能［9］。

2 NK細胞的功能亞群劃分有所突破

根據(jù)CD56和CD16表達密度的不同，人NK細胞分成CD56brightCD16－NK細胞和CD56dimCD16+NK細胞兩個亞群。CD56dimCD16+NK細胞主要存在于外周血，高水平表達CD16、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體 (KIR)和LFA-1等分子，低表達CD94/NKG2A，僅表達不帶α鏈的中親和力IL-2受體(IL-2Rβγ)，以發(fā)揮殺傷功能為主，產(chǎn)生細胞因子的水平較低;而CD56brightCD16－NK細胞主要在次級淋巴組織中聚集，表達高親和力IL-2受體 (IL-2Rαβγ)，CD94/NKG2A和L選擇素 (CD62L)，低表達CD16和KIR，活化后以分泌細胞因子如 IFN-γ、TNF-β、IL-10、IL-13和GM-CSF等為主要功能，但細胞毒活性低。CD56dimCD16+NK細胞被認為是成熟NK細胞，可能從 CD56brightCD16－NK 細胞發(fā)育而來［10，11］。

由于小鼠NK細胞沒有CD56同源物的表達，因此無法以此對人類和小鼠NK細胞的生物學功能進行比較。但是將CD27和CD11b分子聯(lián)合起來，就可以將小鼠和人類NK細胞皆劃分為CD11blowCD27low、CD11blowCD27high、CD11bhighCD27high和CD11bhighCD27low四個不同的亞群，這些NK細胞亞群處于發(fā)育分化的不同階段，并且表型、功能、組織分布也各具特點。小鼠NK細胞在體內(nèi)可能是沿著CD11blowCD27low→CD11blowCD27high→CD11bhighCD27high→ CD11bhighCD27low路徑發(fā)育分化［12］。我們［13］通過分析蛻膜、臍血、外周血和腫瘤組織中的NK細胞，在人體內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)四個相應亞群的存在，即 CD11b－CD27－DN NK、CD27+SP NK、CD11b+CD27+DP NK和CD11b+SP NK，其中DN NK細胞類似初始NK細胞，有較高分化潛能，幾乎缺乏分泌細胞因子及殺傷功能，CD27+SP NK細胞分泌細胞因子能力很強，CD11b+SP NK細胞殺傷功能很強。人蛻膜NK細胞(dNK)主要是CD27－CD11b－雙陰性NK細胞 (DN)，外周血NK細胞(pNK)和臍血NK細胞(cNK)主要是CD11b+SP NK細胞，腫瘤浸潤NK細胞(TINK)四亞群均出現(xiàn)。

3 NK細胞的功能極化現(xiàn)象較為普遍

如前所述，NK細胞的專職功能一直被認為是抗病毒、殺腫瘤，但近年來發(fā)現(xiàn)局部區(qū)域微環(huán)境可促使NK細胞在不同組織中向不同功能狀態(tài)極化;也可能是外周循環(huán)的NK細胞在趨化因子的作用下遷移至局部組織中而展現(xiàn)出不同的表型和功能，近期的研究已獲得不止于以下的結果。

①肝臟NK細胞。NK細胞約占肝臟浸潤淋巴細胞的一半，表型主要為CD56lowCD16－，與循環(huán)系統(tǒng)中典型的CD56lowCD16+NK不同［14］。正常情況下，肝臟NK細胞居留在肝竇內(nèi)，此處同樣有大量枯否氏細胞，接受腸道共生菌釋放的脂磷壁酸和脂多糖的刺激，分泌大量IL-10，后者可抑制NK細胞對IL-12和IL-18的應答能力，也可上調(diào)NKG2A的表達，使NK細胞處于耐受狀態(tài)。嗜肝性病毒感染后，枯否氏細胞產(chǎn)生大量IL-6和IL-18，活化NK細胞，后者高表達TRAIL、穿孔素和粒酶等，既發(fā)揮抗病毒作用，也有可能介導肝臟損傷。

②子宮蛻膜層CD56highCD16－NK細胞。妊娠期間人類子宮蛻膜層出現(xiàn)一種特有的CD56highCD16－NK細胞亞群，同時表達CD9和CD103，高表達一種或多種KIR分子。盡管在這群細胞上也表達 NKp46、LFA-1、NKG2D、NKp44 等與殺傷相關的分子，但其細胞毒功能明顯減弱。蛻膜NK細胞在表型及功能方面均不同于其他組織器官的NK細胞亞群，可能與孕期子宮局部微環(huán)境有關。這群NK細胞由外周血CD56hiCD16－NK細胞通過趨化因子如CXCR4等作用招募至子宮局部;亦可能是在子宮蛻膜局部發(fā)育分化而來，因為子宮蛻膜層中存在CD34+細胞，該細胞在體外適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下能夠發(fā)育分化為CD56hiCD16－NK細胞。我們發(fā)現(xiàn)，在妊娠初期蛻膜NK細胞表現(xiàn)為CD56brightCD27+，高分泌IFNγ，抑制由于胚胎與母體半基因不合或微生物感染而在局部形成的Th17細胞，維持母胎免疫耐受，是NK細胞調(diào)節(jié)功能的重要體現(xiàn)［15］。

③黏膜系統(tǒng)CD56+NKp44+NK細胞。開放的黏膜環(huán)境存在多種抗原刺激，是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線。在人和鼠的黏膜系統(tǒng)中存在一群 CD56+NKp44+的 NK細胞，該群細胞表達CCR6、CD96和CD103等多種向黏膜遷移的受體，此外還分泌CCR6的配體CCL20，不僅構成對自身向黏膜遷移的正反饋，也促進了其他免疫細胞向黏膜遷移。CD56+NKp44+NK細胞以分泌IL-22為主要功能，同時還能分泌IL-26、LIF等多種黏膜免疫相關細胞因子，但不分泌IL-17，因此這群細胞被命名為 NK-22［16］。NK-22細胞的標志初定為 CD56+CD127+RORγt+，其表型類似于不成熟NK細胞，主要表達NKp44、NKp30和NKp46，低表達顆粒酶 A和穿孔素，不表達 NKG2D、KIR2DL2-KIR2DL3和CD94，可能與維持腸道穩(wěn)態(tài)密切相關。為了進一步規(guī)范NK細胞的命名與分類，最近提出天然淋巴細胞(innate lymphoid cells，ILCs)的概念，把經(jīng)典的NK細胞和T-bet+的ILC稱為ILC1，把ROR α+，分泌IL-5或IL-13的ILC稱為 ILC2，把 ROR γt+，分泌IL-22或 IL-17的 ILC 稱為 ILC3［17］。

除上述NK細胞在組織局部表現(xiàn)出不同功能以外，我們也發(fā)現(xiàn)在SLE患者體內(nèi)，由于IFNα高表達活化CD226+NK細胞，后者浸潤腎臟組織，介導腎臟損傷［18］。我們在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤NK細胞(TINK)以CD27－CD11b－DN NK居多，失去殺傷腫瘤的功能。在HBV免疫耐受期(IT期，HBV DNA陽性、肝功能正常)病人體內(nèi)的NK細胞，兩種重要的活化性受體或共刺激分子NKG2D和2B4及其接頭分子DAP10和SAP均明顯降低，導致NK細胞表現(xiàn)為耐受狀態(tài)，失去效應功能，HBV得以在體內(nèi)持續(xù)性感染［19］。

4 NK細胞發(fā)育分化與功能極化機制知之甚少

NK細胞前期發(fā)育、亞群分化和功能極化的過程已經(jīng)如上所述，但調(diào)控上述過程發(fā)生的機制知之甚少，遠達不到對T細胞亞群極化和功能調(diào)控的認識水平，但借鑒T細胞的知識，可以推測NK細胞從外周進入組織、在局部變換功能，可能需要趨化因子驅動、黏附分子固著和轉錄因子激活等必要條件。

NK細胞表達多種趨化因子受體［20］，受局部組織微環(huán)境分泌趨化因子的影響，可能被吸引至不同組織，如靜息狀態(tài)的CD56dimCD16+NK細胞高表達CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4 和 CX3CR1;靜息狀態(tài)的 CD56brightCD16－NK細胞高表達 CCR5和CCR7。這些受體與對應的趨化因子相互作用，調(diào)控NK細胞向不同組織中遷移、募集繼而發(fā)揮生物學功能，如妊娠期間外周血CD56hiCD16－NK細胞能在趨化因子CXCL12等的招募下遷移至子宮局部。

NK細胞還表達黏附分子受體CD2、CD226、β1 integrins和β2 integrins等，對NK細胞在組織居留和捕獲靶細胞至關重要。如NK細胞能夠殺傷多種高表達CD226分子配體的實體瘤細胞和造血系統(tǒng)來源的腫瘤細胞，當NK細胞與腫瘤靶細胞相互接觸時，CD226、LFA-1等黏附分子與腫瘤細胞表達的配體分子相互作用，隨后可能會引起細胞骨架的改變并引起活化性受體在NK細胞表面成簇，最終促使NK 細胞的激活［21］。

轉錄因子激活可能是NK細胞發(fā)育分化和功能極化的關鍵因素，雖然目前在此領域研究進展緩慢，但仍有部分可喜結果。如E4pb4、Id2和PU.1可促使 NK 前體細胞發(fā)育為靜止 NK 細胞［22，23］，T-bet可維持NK細胞的譜系發(fā)育和NK細胞庫的穩(wěn)態(tài)，T-bet和Eomes可共同促進NK細胞的成熟，直至發(fā)揮效應功能［24，25］。需要指出的是，有關結果主要從小鼠的研究中獲得。除此之外，我們證明microRNA也可調(diào)控NK細胞的功能，我們發(fā)現(xiàn)胚胎局部的NK細胞高表達miR-483-3p，該分子在胚胎NK細胞中的表達量是正常NK細胞表達量的近萬倍，導致胚胎NK細胞不能分泌生長因子IGF-1，失去殺傷功能，轉而分泌 IFN-γ，維持免疫調(diào)節(jié)功能［26］。

5 小結

NK細胞發(fā)育分化和功能極化機制研究緩慢的主要障礙是臨床基礎研究缺乏直接分析人體NK細胞的手段，實驗動物研究缺乏NK細胞各種缺陷鼠，但隨著體外NK細胞發(fā)育分化體系的建立，和各類組織中NK細胞功能的陸續(xù)鑒定，我們對人NK細胞的發(fā)育分化和功能極化有了較深入的認識，初步認為NK細胞在生理和病理微環(huán)境中，可能發(fā)生“程序性增殖”現(xiàn)象，表現(xiàn)為生理微環(huán)境中的SCF、Flt3-L、IL-7和IL-15等多種細胞因子啟動NK細胞的發(fā)育分化，病理微環(huán)境中不斷產(chǎn)生并積聚的炎性因子，持續(xù)性、進行性促進NK細胞的增殖和功能極化，當NK細胞到達炎癥核心部位、也是局部炎性因子濃度最高部位時，終于獲得特定的免疫功能，類似現(xiàn)象在CD8+T細胞中已有初步描述［27］。概括而言，生理微環(huán)境賦予NK細胞的發(fā)育分化，病理微環(huán)境誘導NK細胞的“程序性增殖”，轉錄因子介導NK細胞的功能極化，導致NK細胞在不同微環(huán)境中表現(xiàn)為NKtolerant(抑制性信號占主導、NK細胞失去效應功能)、NKcytotoxic(活化性信號占主導、靶細胞高表達壓力誘導的配體)、NKregulatory(活化性信號占主導、靶細胞高表達炎性分子)等不同功能狀態(tài)，最終在效應微環(huán)境中發(fā)揮機體所需要的免疫功能(圖1)。

圖1 NK細胞的發(fā)育分化與功能極化Fig.1 Development，differentiation and functions of NK cells

［1］Vivier E，Tomasello E，Baratin M，et al.Functions of natural killer cells［J］.Nat Immunol，2008，9(5):503-510.

［2］Parham P，Moffett A.Variable NK cell receptors and their MHC class I ligands in immunity，reproduction and human evolution［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(2):133-144.

［3］Shi F，Ljunggren H，Cava A，et al.Organ-specific features of natural killer cells［J］.Nat Rev Immunol，2011，11(10):658-671.

［4］Vivier E，Raulet DH，Moretta A，et al.Innate or adaptive immunity?The example of natural killer cells［J］.Science，2011，331(6013):44-49.

［5］Caligiuri M.Human natural killer cell［J］.Blood，2008，112(3):461-469.

［6］Freud A，Becknell B，Roychowdhury S，et al.A human CD34(+)subset resides in lymph nodes and differentiates into CD56brightnatural killer cells［J］.Immunity，2005，22(3):295-304.

［7］Chinen H，Matsuoka K，Sato T，et al.Lamina propria c-kit+immune precursors reside in human adult intestine and differentiate into natural killer cells［J］.Gastroenterology，2007，133(2):559-573.

［8］Chan A，Hong DL，Atzberger A，et al.CD56brighthuman NK cells differentiate into CD56dimcells:role of contact with peripheral fibroblasts［J］.J Immunol，2007，179(1):89-94.

［9］Hoglund P，Brodin P.Current perspectives of natural killer cell education by MHC class I molecules［J］.Nat Rev Immunol，2010，10(10):724-734.

［10］Yu J，Mao HC，Wei M，et al.CD94 surface density identifies a functional intermediary between the CD56brightand CD56dimhuman NK-cell subsets［J］.Blood，2010，115(2):274-281.

［11］Bjorkstrom NK，Riese P，Heuts F，et al.Expression patterns of NKG2A，KIR，and CD57 define a process of CD56dimNK-cell differentiation uncoupled from NK cell education［J］.Blood，2010，116(19):3853-3864.

［12］Chiossone L，Chaix J，F(xiàn)useri N，et al.Maturation of mouse NK cells is a 4-stage developmental program［J］.Blood，2009，113(22):5488-5496.

［13］Fu B，Wang F，Sun R，et al.CD11b and CD27 reflect distinct population and functional specialization in human natural killer cells［J］.Immunology，2011，133(3):350-359.

［14］Huntington N，Vosshenrich C，Di Santo J.Developmental pathways that generate natural-killer-cell diversity in mice and humans［J］.Nat Rev Immunol，2007，7(9):703-714.

［15］Fu B，Li X，Sun R，et al.Natural killer cells promote immune tolerance by regulating inflammatory TH17 cells at the human maternal-fetal interface［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(3):E231-E240.

［16］Cella M，F(xiàn)uchs A，Vermi W，et al.A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity［J］.Nature，2009，457(7230):722-725.

［17］Spits H，Artis D，Colonna M，et al.Innate lymphoid cells-a proposal for uniform nomenclature［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(2):145-149.

［18］Huang Z，F(xiàn)u B，Zheng SG，et al.Involvement of CD226+NK cells in immunopathogenesis of systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2011，186(6):3421-3431.

［19］Sun C，F(xiàn)u B，Gao Y，et al.TGF-β1 down-regulation of NKG2D/DAP10 and 2B4/SAP expression on human NK cells contributes to HBV persistence［J］.PLoS Pathog，2012，8(3):e1002594.

［20］Bernardini G，Gismondi A，Santoni A.Chemokines and NK cells:regulators of development，trafficking and functions［J］.Immunol Lett，2012，145(1-2):39-46.

［21］Fuchs A，Colonna M.The role of NK cell recognition of nectin and nectin-like proteins in tumor immunosurveillance［J］.Semin Cancer Biol，2006，16(5):359-366.

［22］Gascoyne DM，Long E，Veiga-Fernandes H，et al.The basic leucine zipper transcription factor E4BP4 is essential for natural killer cell development［J］.Nat Immunol，2009，10(10):1118-1124.

［23］Hesslein D，Lanier L.Transcriptional control of natural killer cell development and function［J］.Adv Immunol，2011，109:45-85.

［24］Gordon SM，Chaix J，Rupp LJ，et al.The transcription factors T-bet and Eomes control key checkpoints of natural killer cell maturation［J］.Immunity，2012，36(1):55-67.

［25］Jiang X，Chen Y，Peng H，et al.Single line or parallel lines:NK cell differentiation driven by T-bet and Eomes［J］.Cell Mol Immunol，2012，9(3):193-194.

［26］Ni F，Sun R，F(xiàn)u B，et al.IGF-1 promotes the development and cytotoxic activity of human NK cells［J］.Nat Commun，2013，4:1479.

［27］Raue H，Beadling C，Haun J，et al.Cytokine-mediated programmed proliferation of virus-specific CD8+memory T cells［J］.Immunity，2013，38(1):131-139.