苯扎貝特對原發性膽汁性肝硬化患者外周血CD4+T細胞的抑制作用研究①

陳曲波 彭桉平 黎翠翠 趙 蓉 盧欣沂 何 敏 周麗敏 吳煒霖

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院免疫室，廣州 510120)

原發性膽汁性肝硬化(PBC)是由自身免疫機制介導的，以肝內小膽管進行性、非化膿性炎癥為特征的慢性膽汁淤積性疾病，并進一步發展為肝纖維化、肝硬化，最終導致肝功能衰竭。盡管PBC的病因和發病機制還不清楚，但有許多證據表明自身反應性T細胞參與發病，并對膽小管破壞起重要作用。研究顯示在原發性膽汁性肝硬化患者肝臟組織存在顯著的T細胞浸潤，尤其在匯管區浸潤的T細胞中以CD4+T細胞為主，表現為增強的Th1、Th17細胞介導的自身免疫反應及低下的Treg細胞反應［1］。傳統降脂藥苯扎貝特能降低PBC患者外周血Fas抗原陽性 T細胞的比率，具有一定程度的抗炎作用［2］。一些對熊去氧膽酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)耐藥的PBC患者使用BF單一療法，有50%可達到很好療效，且UDCA聯合BF治療可使大多數病人的生化和免疫指標達到正常水平，明顯改善臨床癥狀，且沒有任何的副作用，故BF聯合UDCA可能對UDCA耐藥的PBC患者是一種有效的治療方法［3］，但其免疫抑制機制不清楚。本研究通過BF體外干預PBC患者CD4+T細胞增殖和分化，闡述其免疫抑制作用機理，為臨床應用BF提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 PBC患者15例，女性12例，男性3例，平均年齡(66.5±16.8)歲，均來自2010年12月至2011年10月就診于廣東省中醫院的門診或住院病例。PBC組入選標準參考2009年歐洲和美國同時制定的新指南:①臨床出現膽汁淤積癥狀，如黃疸、皮膚瘙癢、疲勞等;②AMA≥1∶40，尤其是AMAM2陽性，有膽汁淤積的生物化學改變(ALP和GGT升高且無其他原因)，B超檢查膽道系統正常;③肝活組織檢查符合PBC改變。符合上述三項可確診為PBC，符合前兩項者但未進行肝活組織檢查視為可疑PBC。所有患者臨床表現各異，肝功能指標中ALT、AST、GGT、ALP 及 TBA 均明顯異常，均無其他肝臟相關疾病及自身免疫性疾病。

1.2 CD4+T細胞的分選和培養 收集患者外周肝素抗凝血15 ml，分離外周血單個核細胞(PBMC)。采用德國Miltenyi公司磁珠分選試劑盒分選CD4+T細胞，分選純度大于97%。將分選的CD4+T細胞加入RPMI1640培養液，以細胞數為2×105L－1的細胞懸液加入到96孔 U型板中，在anti-CD3(1 μg/ml)和anti-CD28(1 μg/ml)的刺激條件下，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)。于 37℃、5%CO2細胞培養箱中培養細胞，于不同時間收集細胞或上清進行下續實驗。

1.3 CD69和CD25表達水平檢測 分別于CD4+T細胞培養36 h及72 h后，收集細胞檢測CD69及CD25分子表達。收集細胞，離心(1 500 r/min，5 min)，制成細胞懸液，加入抗人FITC-CD69抗體或抗人PE-CD25抗體表面染色，4℃避光孵育30 min，洗滌(1 500 r/min，5 min)染色細胞重懸，采用BD CantoⅡ流式細胞檢測儀檢測，FACS Diva6.0軟件分析流式檢測結果。流式抗體購自美國eBioscience公司。

1.4 CFSE標記CD4+T細胞 將分選的CD4+T細胞加入RPMI1640培養液，調整細胞數1×106/L－1，將CFSE加入細胞懸液中(終濃度5 μmol/L)，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)，培養 7 d。培養第1天起在各孔均加入 anti-CD3(1 μg/ml)、anti-CD28(1 μg/ml)。于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行細胞培養，隔2 d換液，采用BD CantoⅡ流式細胞檢測儀檢測CD4+T細胞增殖情況。

1.5 IL-17和IFN-γ水平檢測 收集細胞培養上清液，按北京達科為有限公司ELISA試劑盒說明書嚴格操作。

1.6 IL-17和IFN-γ胞內水平檢測 將培養7 d后的細胞在刺激劑PMA、Inomycin與monensin刺激下繼續培養4 h。收集上述培養后的細胞，離心(1 500 r/min，5 min)，制成細胞懸液，加入抗人PECY7-CD4抗體表面染色，4℃避光孵育30 min，洗滌(1 500 r/min，5 min)，固定破膜。加入抗人 FITC-IL-17、APCIFN-γ抗體胞內染色，4℃避光孵育30 min，離心洗滌(1 500 r/min，5 min)，cell staining buffer重懸，采用BD CantoⅡ流式細胞檢測儀檢測，FACS Diva6.0軟件分析流式檢測結果。流式抗體購自美國ebioscience公司。

2 結果

2.1 BF抑制PBC患者CD4+T細胞活化 PBC患者CD4+T細胞在anti-CD3和anti-CD28單抗的刺激條件下，加入不同濃度的 BF(0、10、50、100 μmol/L)培養后，FCM檢測早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25表達情況。結果表明(圖1)，隨著BF濃度的增加，CD69和CD25的表達率均相應地下降，尤其在100 μmol/L的BF干預濃度下，兩者的表達抑制率均達到10%左右，進一步提示了BF呈濃度依賴性地部分抑制CD4+T細胞的早中期活化。

2.2 BF抑制PBC患者CD4+T細胞增殖 CFSE標記的PBC患者CD4+T細胞在anti-CD3和anti-CD28單抗的刺激條件下，加入不同濃度的BF(0、10、50、100 μmol/L)進行培養 7 d，FCM 檢測CD4+T細胞增殖。結果表明(圖2)，無BF干預時，CD4+T細胞增殖明顯(7代)，其增殖率隨著BF干預濃度增加而降低，50 μmol/L明顯抑制CD4+T細胞增殖。

2.3 BF抑制PBC患者CD4+T細胞培養上清中IL-17和IFN-γ表達 ELISA法檢測未處理組及BF處理組中IL-17和IFN-γ水平差異，顯示BF處理組中IL-17和IFN-γ水平較未處理組明顯降低(圖3，P＜0.05)。

圖1 BF抑制PBC患者CD4+T細胞CD69和CD25的表達Fig.1 Expression of CD69 and CD25 on CD4+T cells of PBC patients by bezafibrate suppressing

圖2 BF抑制PBC患者CD4+T細胞增殖Fig.2 Inhibition efficiency of bezafibrate on CD4+T cells proliferation in PBC patients

圖3 BF抑制PBC患者CD4+T細胞培養上清中IL-17和IFN-γ表達Fig.3 Expression of IL-17 and IFN-γ in CD4+T cells culture supernatants of PBC patients by BF suppressing

2.4 BF 抑制 PBC 患者 IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和IFN-γ－IL-17+CD4+T細胞各亞群細胞因子分泌 CD4+T細胞在anti-CD3和anti-CD28單抗刺激條件下，根據IFN-γ和IL-17的產生情況，可以將CD4+T細胞分為3個不同亞群，分別為IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+細胞，而 BF 對各亞群細胞因子分泌都有不同程度的抑制，且呈濃度依賴性(圖4，P ＜0.05)。

3 討論

圖4 BF抑制PBC患者CD4+T細胞各亞群細胞因子(IFN-γ+IL-17－/IFN-γ+IL-17+/IFN-γ－IL-17+)的分泌Fig.4 Flow cytometry analyzed CD4+T cells subgroup cytokine secretion in PBC patients by BF suppressing

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)除參與脂質和葡萄糖代謝外還可參與炎癥反應，PPARs屬于核受體，是一類配體激活的核轉錄因子，在特定配體激活下，可抑制多種炎癥因子的表達。BF是非選擇性的脂質PPARs激動劑，兼而具有激動PPARα、PPARδ、PPARγ的作用，其中以α亞型親和力最高。近年國外臨床實踐發現BF對PBC患者也有一定臨床療效，對UDCA耐藥的PBC患者單用或聯合使用BF，可明顯改善臨床癥狀，可能是BF能通過PPARα增加多重耐藥基因(MDR3)表達和誘導MDR3-P糖蛋白的表達，使磷脂分泌到膽汁，與疏水膽汁酸形成膠體對膽管上皮起保護作用，但其具體作用機理不明。故本文著重以PBC患者為研究對象，探討BF治療PBC的某些機制。

PBC是以肝內小膽管進行性、非化膿性炎癥為特征的自身免疫疾病，其病因和確切發病機制至今尚不完全清楚，目前認為CD4+T細胞介導的自身免疫反應在PBC發病過程中發揮了重要作用。CD4+T細胞的異?；罨驮鲋吃赑BC發病過程中起關鍵作用。故而抑制其活化和增殖對于PBC的治療具有重要意義。在T細胞的活化中，CD69不僅是它的早期活化標記分子，還可作為細胞的共刺激信號進一步加強細胞的增殖分化［4］;CD25作為T細胞中期活化分子，是IL-2受體(IL-2R)α鏈，可與IL-2Rβ鏈、IL-2Rγ鏈組成IL-2R，進一步與IL-2結合，誘導細胞的增殖分化［5］。CD69和CD25作為T細胞不同時期的活化標記，可反映T細胞的活化水平，兩者在BF的干預下均出現表達的下調，從而表明BF可抑制CD4+T細胞的活化。而T細胞活化是早期免疫應答的重要表現，選擇性阻斷T細胞異?；罨蛇M一步抑制T細胞的增殖分化，阻止其介導的自身免疫反應，因此，本研究還采用活體染料CFSE標記追蹤PBC患者CD4+T細胞增殖，顯示BF對PBC患者外周血分離的經抗CD3/CD28刺激的CD4+T細胞的增殖具有抑制作用，提示BF可通過抑制CD4+T細胞的活化增殖來抑制PBC患者體內異常的免疫反應。

CD4+T細胞根據其產生的細胞因子不同而分為不同的亞群，分別為Th1、Th2及Th17。Th1細胞產生IFN-γ，參與細胞介導的免疫反應;Th2細胞產生IL-4，參與體液介導的免疫反應;Th17細胞產生IL-17，在防御胞外菌感染、介導慢性炎癥以及自身免疫病中發揮重要作用［6-11］。目前已發現許多Th1與Th17細胞因子的表達水平與PBC患者的發生發展密切相關。文獻報道，活動性PBC患者外周血Th細胞表達IFN-γ和/或IL-17的水平明顯升高。而來自臨床試驗及動物實驗的結果也顯示，IFN-γ和/或IL-17在PBC致病機制中發揮了重要的作用［12］。而Th17細胞又可進一步分為表達IL-17+IFN-γ+和IL-17+IFN-γ－兩類細胞群，表達 IL-17+IFN-γ+的Th17/Th1細胞在近年研究中也備受關注。已在小鼠模型的實驗中發現Th17/Th1比只分泌IL-17的Th17細胞更具致病性［13］。而在PBC患者中這兩類細胞群誰起最主要的致病作用，還是都起作用還需進一步的證明。ELISA結果發現BF呈濃度依賴抑制PBC患者外周血CD4+T細胞IL-17和IFN-γ的分泌，進一步流式結果顯示BF抑制CD4+T細胞中IFN-γ+IL-17－、IFN-γ+IL-17+和 IFN-γ－IL-17+各亞群細胞的分化，提示BF抑制Th1及Th17細胞分化和其細胞因子釋放，可能有助于緩解PBC急性期及慢性期過度的系統性炎癥反應。然而BF抑制IFN-γ在50 μmol/L與100 μmol/L濃度差異有顯著性，而對IL-17抑制50 μmol/L與100 μmol/L濃度差異無顯著性，提示BF可能是通過不同的作用途徑影響CD4+T細胞分化與細胞因子分泌。

總之，本研究從活化增殖、細胞因子分泌和細胞分化等多方面檢測了BF對PBC患者CD4+T細胞的干預作用，顯示BF可通過抑制CD4+T細胞活化增殖、細胞因子的分泌及Th1、Th17細胞分化發揮免疫抑制作用。為臨床上應用BF治療PBC提供新的理論依據。

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