丁苯酞對腦缺血再灌注大鼠HSP70及TLR4的影響研究

張曉璇 邱海鵬 趙淑敏(河北承德附屬醫院神經內科一病區，承德 067000)

缺血再灌注損傷在腦缺血疾病中非常常見，其對腦組織的損傷程度遠超過單純的腦組織缺血［1］，而其損傷機制主要與再灌注下的氧自由基生成增多，炎癥反應的亢進及細胞凋亡的改變有關［2］。因此在缺血性疾病中，調控細胞凋亡和控制炎癥反應能夠顯著地改善再灌注所導致的組織損傷，從而保護神經功能，這已經成為腦缺血性疾病治療中的重要方向［3］。已有大量研究證實 HSP70(Heat shock protein，熱休克蛋白的一種)能夠抑制細胞的凋亡和壞死，并可激活TLR4(Toll-like receptor 4，Toll樣受體)，而TLR4的激活可直接觸發機體的炎癥應答反應，導致了缺血再灌注損傷［4］。NBP(Butylph-thalide，丁苯酞)在缺血再灌注損傷中的應用療效非常令人滿意，其能有效地保護神經功能，但具體機制仍沒有定論。本研究即是探討在NBP預處理對于缺血再灌注模型大鼠的HSP70和TLR4的表達有著怎樣的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 144只清潔級健康成年雄性SD大鼠(天津山川紅實驗動物中心提供，動物許可證號為:SCXK(津)2009-0001)，體質量在220～260 g之間。

1.1.2 藥品和儀器 本研究中所涉及的主要藥品及儀器包括:NBP(丁苯酞)由石藥集團恩必普藥業有限公司生產，H20050299;TUNEL(細胞凋亡檢測試劑盒)由上海晶天生物公司提供;SP免疫組化試劑盒、兔抗鼠HSP70、TLR4抗體均購自北京博奧森生物公司;水合氯醛、多聚甲醛、烏拉坦均由天津市福晨化學試劑廠生產;醫學圖像分析系統及光學顯微鏡均由成都泰盟公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將144只實驗大鼠隨機分成:Sham組(假手術組)、IR組(缺血再灌注組)、NBP組(給予NBP干預的缺血再灌注組)3組各48只，各組再根據缺血2 h后再灌注的時間按6、12、24和48 h分為4個小組，每小組各12只。NBP組為建立缺血再灌注模型后立即給予80 mg/kg NBP灌胃，每日一次。而Sham和IR組作為對照組，給予與NBP量相等的生理鹽水來灌胃。

1.2.2 建立模型 IR組和NBP組缺血再灌注大鼠模型的建立通過Zea Longa改良方法。用10%的水合氯醛進行麻醉，劑量為300 mg/kg，栓塞MCA(大腦中動脈)，缺血時間為2 h，再灌注分為6、12、24和48 h。IR組和NBP組魚線插入頸內動脈約17～18 mm，閉塞大腦中動脈，而Sham組魚線僅插入頸內動脈約8～10 mm，并不對大腦中動脈進行閉塞。

1.2.3 神經功能缺損評分 大鼠缺血再灌注模型完成后，待大鼠清醒，根據Zea-longa標準行大鼠的神經功能缺損評分［5］，具體評分標準如下:0分為行動如常、無癥狀;1分為出現的神經功能缺失癥狀為輕度(提大鼠尾可見左前肢屈曲);2分為出現的神經功能缺失癥狀為中度(大鼠向左側旋轉);3分為出現的神經功能缺失癥狀為重度(大鼠運動向左側傾倒);4分為大鼠喪失意識。

1.2.4 制備標本 在各計劃時間點將大鼠腹腔注射烏拉麻醉。開胸，暴露心臟，左室予生理鹽水洗凈后予多聚甲醛固定。開顱取腦組織(視交叉前后約2 mm)固定脫水，行石蠟塊包埋，切片(厚約2 μm)備用。

1.2.5 檢測細胞凋亡(TUNEL法) TUNEL染色方法主要包括石蠟切片脫蠟，PBS洗滌，TUNEL混合液37℃ 60 min孵育，PBS洗滌，加轉化劑POD，加DAB顯色液，蘇木精復染等。將切片在250倍熒光顯微鏡下觀察、分析，在缺血部位海馬CA1區取并不重疊的視野6個，并采用病理彩色圖像分析系統觀察，統計凋亡細胞數(棕黃色熒光者)，取平均值。

1.2.6 免疫組化染色 用SP法將切片脫蠟，過氧化氫孵育約15 min，PBS洗滌，在2 min的高壓抗原修復后分別滴加 HSP70和 TLR4的抗體(均為1∶150)，37℃孵育2 h;PBS洗滌后分別滴加二抗工作液，37℃孵育30 min;再次用PBS洗滌后予DAB顯色脫水，然后復染并封片。400倍光鏡下觀察并計算缺血部位海馬CA1區HSP70和TLR4染色陽性細胞數(取不重復的視野5個，取均值)。

1.2.7 Western blot檢測HSP70和TLR4蛋白表達水平 缺血再灌注7 d后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，經心尖灌注生理鹽水后取缺血側海馬組織標本，使用組織總蛋白提取試劑，根據說明書步驟進行核和胞漿蛋白的提取，用于HSP70和TLR4的表達檢測，BCA法蛋白定量，取蛋白樣品50 μg，電泳后轉膜，5% 的脫脂奶粉封閉 1 h，β-actin、HSP70 和TLR4抗體用5%牛奶稀釋(1∶200)，4℃過夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，洗膜后，按照ECL說明書，1∶1配置發光工作液，凝膠成像儀成像，Image J軟件進行灰度分析。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS19.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，比較采用t檢驗。P＜0.05定義為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分的比較 Sham組的大鼠神經功能缺損評分均為0。IR組和NBP組不同灌注時間下各分組的大鼠神經功能缺損評分詳見表1。結果提示:再灌注時間為12、24和48 h時，NBP組的神經功能缺損評分均低于IR組(P均＜0.05)。

2.2 細胞凋亡比較 Sham組、IR組、NBP組在不同灌注時間下各分組的大鼠大腦皮層細胞凋亡數量詳見表2和圖1(凋亡細胞數為單個高倍鏡視野下的數量，6個視野取均值)。結果提示:IR、NBP組任意灌注時間段的凋亡細胞數均顯著高于Sham組(P均 ＜0.01)，灌注時間為6、12、24、48 h 時，NBP 組的細胞凋亡數均顯著低于IR組(P均＜0.01)。

表1 IR和NBP組不同灌注時間下神經功能缺損評分比較Tab.1 Comparison of neurological deficit scores in IR and NBP group with different perfusion time

2.3 各組大鼠HSP-70陽性細胞數比較 Sham組、IR組、NBP組在不同灌注時間下各分組的大鼠HSP-70陽性細胞數目詳見表3。結果提示:IR、NBP組任意時間段的HSP-70陽性細胞數目均顯著高于Sham組(P均＜0.01)，同樣，IR組任意灌注時間段的HSP-70陽性細胞數目均顯著高于NBP組(P均＜0.01)。

2.4 各組大鼠TLR4陽性細胞數比較 Sham組、IR組、NBP組在不同灌注時間下各分組的大鼠TLR4陽性細胞數目詳見表4。結果提示:IR、NBP組任意時間段的TLR4陽性細胞數目均顯著高于Sham組(P均＜0.01)，同樣，IR組任意灌注時間段的TLR4陽性細胞數目均顯著高于NBP組(P均＜0.01)。

表2 不同灌注時間下各組細胞凋亡比較Tab.2 Apoptosis of cell in each group at different perfusion time

圖1 灌注48 h后各組腦組織TUNEL染色代表性圖片(TUNEL陽性結果為胞核棕色)Fig.1 Representative picture of TUNEL stained brain tissue in each group after perfusion for 48 h

表3 不同灌注時間下各組大鼠HSP-70陽性細胞數比較Tab.3 Comparison HSP-70 positive cells in rats at different perfusion time in each group

表4 不同灌注時間下各組大鼠TLR4陽性細胞數比較Tab.4 Comparison TLR4 positive cells in rats at different perfusion time in each group

表5 灌注48 h后三組TLR4和HSP70表達的Western blot檢測結果灰度分析Tab.5 Grayscale analysis of Western blot test results of Hsp70 and TLR4 expression after infusion for 48 h in three groups

圖2 灌注48 h后三組TLR4和HSP70表達的免疫組化檢測結果Fig.2 Results of immunohistochemical detection of HSP70 and TLR4 expression in three group after infusion for 48 h

圖3 灌注48 h后三組TLR4和HSP70表達的Western blot檢測結果Fig.3 Western blot test results of HSP70 and TLR4 expression after infusion for 48 h in three groups

2.5 灌注48 h后三組TLR4和HSP70的表達 與Sham組相比，再灌注后48 h，HSP70和TLR4的表達明顯升高(P＜0.05);NBP可以明顯降低TLR和HSP70的表達(P＜0.05)。見表5和圖2、3。

3 討論

腦組織細胞對缺血非常敏感，若缺血時間較長，則會導致腦組織神經細胞的不可逆性損傷。而缺血再灌注所致的損傷更為嚴重，這與缺血再灌注狀態下氧自由基的生成增多、炎癥反應的亢進及細胞凋亡的改變有著密切的聯系［6］。NBP(丁苯酞)在缺血再灌注損傷中的應用療效已有大量相關研究，同樣本研究結果發現給予NBP預處理的大鼠神經功能缺損評分明顯低于IR組，肯定了NBP在改善缺血再灌注所致神經功能損傷中的作用，并且改善的程度與再灌注時間及開始給予NBP的時間有著顯著的關系［7］。本研究探討了NBP預處理對于缺血再灌注模型大鼠的HSP70和TLR4表達的影響，結果發現在本研究中的任意灌注時間段內，NBP和IR組的凋亡細胞數均顯著高于Sham組，提示了在缺血再灌注大鼠模型中，細胞的凋亡數目顯著增多。國際上曾有研究證實導致缺血再灌注受損的機制之一是細胞凋亡的改變，上述研究結果與此結果恰好相吻合。而NBP組的細胞凋亡數均顯著低于IR組，提示在NBP的作用下，缺血再灌注模型的細胞凋亡增加狀況有所改善。而熱休克蛋白HSP70本身能夠抑制細胞的凋亡和壞死，還能夠通過激活TLR4，進而激發機體的炎癥反應［9］，產生大量的炎癥介質和氧自由基，對神經細胞產生損傷［10］。本研究中同樣證實了NBP、IR組的HSP70和TLR4陽性細胞數顯著高于Sham組，而NBP組的HSP70和TLR4陽性細胞數也顯著低于IR組，證實了在缺血再灌注模型中，大鼠的HSP70和TLR4表達均受到了抑制［11］，而給予NBP處理后的凋亡細胞數顯著減少，但距離Sham假手術組還有一定的差異。

綜上，結合我們的研究結果發現，NBP可以抑制HSP70和TLR4(高表達的細胞不一定是凋亡細胞)的表達，降低細胞的凋亡數和機體炎癥反應，從而起到保護神經功能的作用。

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