糖尿病胃輕癱大鼠模型衍變過程相關指標的觀察

萬全荃，賀鳳娥，林亞平*

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

成功的糖尿病 （DM） 模型是糖尿病胃輕癱（DGP）模型成功的基礎。 近年的文獻資料中以鏈脲佐菌素（STZ）建立DM 模型較多，而關于DGP 模型研究較少， 在選用STZ 造模的劑量上亦各持己見，并且前人在DGP 模型的制作過程中缺乏其由DM并發(fā)DGP 過程中相關指標變化的詳細記錄。而本實驗在總結前人DM 與DGP 造模方法的基礎上，以2%STZ [0.1 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2，4 ℃)配成2%，按50、55、60 mg/kg 的劑量]進行預實驗， 進一步肯定DM 大鼠模型用藥劑量為55 mg/kg， 并給以滋膩礙胃高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)，成功建立DGP 模型。通過觀察記錄DGP 大鼠模型每周相關指標積分情況， 直觀反映了DM 并發(fā)DGP 的發(fā)展過程， 一定程度上彌補了以往DPG 造模方法缺乏詳細癥狀改變情況記錄的不足，并為后期基于此模型的研究提供了具體的數(shù)據(jù)支持。 現(xiàn)將正式實驗的方法與結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康SPF 級SD 大鼠90 只， 雌雄各半， 體質量（231±10）g， 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：43004700002152。 均經血糖儀檢測、尿糖試紙檢測，血糖正常、尿糖陰性者入選[1]。 將大鼠隨機分為空白組（下簡稱A 組）12 只、STZ 造模組（下簡稱B 組）78 只。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級實驗動物房， 飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，濕度40%～60%，自然采光。

1.2 動物飼料[1]

高糖高脂飼料含普通飼料、 熟豬油、 蔗糖、奶粉、雞蛋之比為58∶15∶20∶5∶2。 普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（美國sigma 公司，015H1492）臨用前用0.1 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2，4 ℃)配成2%濃度；尿糖試紙（廣州市花都高爾寶生物技術有限公司）；檸檬酸鈉、檸檬酸、NaOH（湖南匯虹試劑公司）；酚紅（天津市恒興化學試劑制造有限公司）； 三氯乙酸 （天津市科密歐化學試劑有限公司）； 血糖儀及血糖試紙 （美國強生公司穩(wěn)易倍健型）；電子天平（日本島津AEL-120 型）；制冰機（三洋SIM-F140）； 紫外分光光度計 （日本島津 UV-1800）。

1.4 造模方法與成模標志

根據(jù)參考文獻[1]， 所有大鼠先適應性飼養(yǎng)1周。 禁食12 h，A 組大鼠單次腹腔注射等容量的0.1 mmoL/(pH 4.2，4 ℃)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，B組以2%STZ 55 mg/kg 的劑量經左下腹腔一次性注射，注射后72 h 取尾靜脈血測大鼠非空腹血糖值，即刻血糖≥16.7 mmol/L 者作為糖尿病大鼠。A 組給予普通飼料規(guī)則喂養(yǎng)；B 組給予高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)， 即采取單日上午和雙日下午進食的辦法，實驗期間均隨意飲水。 DGP 模型成功指標：(1)監(jiān)測大鼠血糖、尿糖。 血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性者；(2) 大鼠一般情況及大便性狀與正常對照組有明顯差別者；(3)大鼠胃排空率及小腸推進率與正常對照組相比有顯著差異者。

1.5 觀察方法與指標采集

1.5.1 一般情況觀察 （1）根據(jù)自制癥狀積分表觀察并記錄糞便性狀，精神狀態(tài)、活動情況、皮毛色澤情況，癥狀積分表見表1；（2）每周以電子秤稱取體質量1 次；（3）每周將大鼠單個放入代謝籠，稱取定量的飼料，24 h 后以電子秤量取剩余飼料量以計算各只大鼠24 h 食量；（4）每周將大鼠單個放入代謝籠， 稱取定量的飲用水，24 h 后以量筒量取剩余水量以計算各只大鼠24 h 飲水量；（5）每周用容器收集各只大鼠24 h 尿量1 次，用量筒測量。

表1 大鼠一般情況評分標準

1.5.2 血糖、 尿糖測定方法 每周以尾靜脈采血，用強生血糖儀和血糖試紙測定血糖值；尿液標本采集以壓迫大鼠下腹部使其膀胱排空， 收集尿液，用尿糖試紙測量尿糖值。血糖＜16.7 mmol/L、尿糖陰性者剔除實驗。

1.5.3 胃排空率測定方法[3-4]實驗前大鼠禁食24 h，禁水2 h。 每只大鼠給予50 mg/dL 酚紅溶液2 mL灌胃，20 min 后處死，剖腹，結扎賁門和幽門，取出整個鼠胃，沿胃大彎切開，以蒸餾水沖洗胃內容物，定容為20 mL。 再加入0.5 mol/L NaOH 20 mL 攪拌混勻，靜置1 h 后取5 mL 上清液，加入20%三氯乙酸0.5 mL 去蛋白， 以3 500 r/min (離心半徑0.1 m) 離心10 min， 取上清液用分光光度計在560 nm 波長下測定吸光度值（OD）。 另取酚紅溶液2 mL， 先后加入蒸餾水18 mL、0.5 mol/L NaOH 20 mL、20%三氯乙酸4 mL 攪拌混勻， 測定吸光度值。

大鼠胃排空率=(1-實測酚紅吸光度/標準酚紅吸光度)×100%。 (水吸光度為0.067，標準酚紅吸光度為2.968)

1.5.4 小腸推進率測定方法[3-4]迅速取出小腸，輕輕剝離后直鋪于白紙上，測量幽門至回盲部全長及幽門至酚紅所到距離，以幽門至酚紅所到位置的距離占幽門至回盲部全長的百分率為小腸推進率。

小腸推進率=酚紅在小腸中的移行距離/小腸全長×100%

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 全部數(shù)據(jù)用“±s”表示。 計量資料滿足正態(tài)性及方差齊性，采用方差分析，不滿足正態(tài)性及方差齊性，以中位數(shù)和四分位間距表示，采用秩和檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般狀況比較

A 組大鼠一般狀況良好，活動正常，反應靈敏，大便性狀無明顯改變，皮毛光澤，實驗期間無動物死亡；B 組大鼠在造模第4 周開始出現(xiàn)精神不佳、活動遲緩，造模第5 周時出現(xiàn)毛色改變及大便性狀改變，稀便與干結便均可見到，第6 周時大鼠開始出現(xiàn)明顯的精神倦怠、反應遲鈍、皮毛稀松泛黃無光澤、大便干稀不調。實驗期間死亡15 只（19.2%）。根據(jù)排除標準：血糖＜16.7 mmol/L、尿糖陰性者剔除實驗15 只（19.2%）。成功造模48 只。癥狀積分結果見表2。

表2 空白組與STZ 造模組大鼠癥狀積分情況 （±s，分）

表2 空白組與STZ 造模組大鼠癥狀積分情況 （±s，分）

注：與A 組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

時間第1 周第2 周第3 周第4 周第5 周第6 周第7 周第8 周空白組（n=12）0 0 0 0 0 0 0 0 STZ 造模組（n=48）0 0 0.27±0.74 0.69±1.26 1.23±1.91*2.81±2.35**5.67±2.42**8.96±1.73**

2.2 兩組大鼠的體質量、食量、飲水量、尿量比較

2.2.1 兩組大鼠體質量比較 A 組大鼠第1 周開始體質量增加，至第8 周，期間體質量較造模前明顯增加（P＜0.01）；B 組大鼠第1 周至第4 周較造模前體質量有所增長（P＜0.01 或P＜0.05），在第5 周開始減輕，至第8 周體質量較造模前明顯降低（P＜0.05）；并且在第1 周至第8 周造模過程中，與A 組比較B 組大鼠體質量明顯減輕 （P＜0.01 或P＜0.05），結果見圖1。

2.2.2 兩組大鼠食量比較 B 組大鼠造模后第1 周食量增多， 至第4 周與第5 周時食量稍減少； 與A組比較， 第6 至第8 周期間食量明顯減少 （P＜0.01或P＜0.05），結果見圖2。

圖1 兩組造模期間大鼠體質量變化曲線圖

圖2 兩組造模期間大鼠食量變化曲線圖

2.2.3 兩組大鼠飲水量比較 與A 組比較，B 組大鼠造模后持續(xù)性出現(xiàn)飲水量顯著性增多 （P＜0.01），結果見圖3。

圖3 兩組造模期間大鼠飲水量變化曲線圖

2.2.4 兩組大鼠尿量比較 與A 組比較，B 組大鼠造模后持續(xù)性出現(xiàn)尿量顯著性增多（P＜0.01），結果見圖4。

結果顯示在腹腔注射鏈脲佐菌素后大鼠迅速出現(xiàn)多食、多飲、多尿，第4 周出現(xiàn)體質量減輕，呈現(xiàn)出典型的糖尿病“三多一少”癥狀。 而在配合高糖高脂飼料不規(guī)則飲食后，造模后期大鼠食量減少，體質量明顯下降，與多飲、多尿形成“二多二少”表現(xiàn)，并且出現(xiàn)精神狀態(tài)、行為活動、皮毛及大便性狀的改變。

圖4 兩組造模期間大鼠尿量變化曲線圖

2.3 兩組大鼠血糖、尿糖比較

造模前，兩組血糖比較無明顯差異，造模8 周期間，每周兩組的血糖比較，B 組血糖明顯升高（P＜0.01）；造模前，兩組的尿糖比較無明顯差異，造模8周期間，每周測得兩組尿糖比較，B 組大鼠尿糖明顯升高（P＜0.01）。 說明腹腔注射鏈脲佐菌素后配合高糖高脂飲食造成大鼠血糖、 尿糖持續(xù)性高于正常值，并達到糖尿病診斷標準，成功造成大鼠糖尿病模型。 結果見表3。

表3 兩組大鼠血糖、尿糖比較

2.4 兩組大鼠胃排空率與小腸推進率比較

根據(jù)后期實驗需要，從B 組中隨機選取12 只大鼠與A 組作胃排空率及小腸推進率比較，模型組大鼠胃排空率、小腸推進率(P＜0.01)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義， 說明在糖尿病模型基礎上配合高糖高脂飲食成功造成大鼠胃腸動力障礙和胃排空延遲， 形成大鼠糖尿病胃輕癱模型。 結果見表4。

表4 兩組大鼠胃排空率、小腸推進率比較 （±s，%）

表4 兩組大鼠胃排空率、小腸推進率比較 （±s，%）

注：與A 組比較**P＜0.01。

組別A 組B 組n 12 12胃排空率66.69±4.41 25.46±2.73**小腸推進率62.53±3.08 45.97±2.20**

3 討論

在前人的DM 及DGP 模型中，對于STZ 劑量的選擇眾說紛紜。 少劑量多次注射可造成2 型糖尿病模型， 大劑量單次注射可造成1 型糖尿病模型，造模劑量選擇范圍在20～60 mg/kg 之間，其中DGP 模型較多采用的是大劑量單次腹腔注射，而其中“大劑量”到底應該是何等劑量呢？ 由于DGP 模型造模時間比較長， 筆者認為劑量過小不能達到成模標準，而劑量過大必定出現(xiàn)死亡率高的情況，故在預實驗中， 筆者以2%STZ 按50、55、60 mg/kg 3 種劑量單次腹腔注射制備糖尿病模型，配以高糖高脂飼料不規(guī)則喂養(yǎng)8 周。 通過預實驗發(fā)現(xiàn)，注射55 mg/kg 劑量的糖尿病大鼠模型在實驗8 周期間一直維持糖尿病高血糖狀態(tài)，并且血糖穩(wěn)定，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，是成功的DM 造模劑量組，為后期的糖尿病胃輕癱造模實驗，給以STZ 劑量選擇的實驗支持。

根據(jù)預實驗結果，在本次實驗中應用2%STZ 按55 mg/kg 單次腹腔注射配合高糖高脂飼料的不規(guī)則喂養(yǎng)成功建立糖尿病胃輕癱模型。 在實驗8 周期間，在監(jiān)測大鼠血糖、尿糖的基礎上，結合兩組大鼠的胃排空率與小腸推進率的比較，B 組大鼠的胃運動消化功能減弱，成功造成了DGP 模型。 根據(jù)實驗8 周大鼠每周的體質量、24 h 食量、24 h 飲水量及24 h 尿量與造模時間的效應曲線，以及兩組大鼠實驗8 周期間的一般癥狀積分的變化情況， 觀察到B組大鼠尿量及飲水量在實驗過程中表現(xiàn)為持續(xù)性的高水平狀態(tài)并未出現(xiàn)明顯波動，食量增多，體質量在造模開始并未立即出現(xiàn)減輕，不符合典型的糖尿病多飲、多食、多尿、體質量減輕的“三多一少”癥狀。 而B 組大鼠在第5 周開始出現(xiàn)體質量的減輕，進而表現(xiàn)出典型的“三多一少”癥狀[5-7]。 通過這一點認為，前5 周實驗成功建立了糖尿病模型。 而在造模第6 周后，大鼠食量開始明顯下降，形成多飲、多尿、少食、體質量減輕的 “二多二少”癥狀特點，并伴有精神萎靡、行為遲緩、皮毛枯黃及大便性狀的改變，故認為第6 周為DGP 開始出現(xiàn)的時間點。 而在造模過程中，B 組大鼠出現(xiàn)的持續(xù)性多飲、 多尿，可能與糖尿病腎病有關[8]；而低血糖、皮膚感染、泌尿道感染及糖尿病足，以及在死鼠解剖中發(fā)現(xiàn)腫瘤等與死亡率息息相關，是今后糖尿病胃輕癱造模過程中值得注意之處。

糖尿病胃輕癱模型已具有40 余年的歷史，其發(fā)展過程中各個基礎指標的變化程度與時間的關系卻鮮少報道。 筆者認為作為一個成熟、實用且常用的模型，過程的觀察非常重要。 在糖尿病胃輕癱模型的建立過程中，本文與以往文獻的關注點并無異同，但本文著重于觀察DGP 模型衍變過程中每周體質量、食量、飲水量、尿量及精神、活動、皮毛、大便等基礎指標的改變，詳盡記錄各項基礎指標隨造模時間變化的程度及趨勢的改變情況，通過DGP 模型衍變過程的觀察： 首先驗證了2%濃度STZ 按55 mg/kg 劑量單次腹腔注射造模方法的可行性；其次，完善了以往缺乏癥狀改變情況詳細記錄的DPG造模過程，為今后基于DGP 模型的研究提供詳細直觀的數(shù)據(jù)參考，并為后期中醫(yī)治療DGP 的機制研究予以實驗數(shù)據(jù)支持。

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