心康沖劑對慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表達的影響

譚 雄，張 輝，聶孝平，王建國，毛湘屏，陳朝暉，毛以林*

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

慢性心力衰竭 （Chronic heart failure，CHF）是各種心血管疾病的終末階段，病死率高，水潴留是其最重要的病理生理變化之一[1]。 研究表明CHF 時水潴留機制的主要途徑：心輸出量下降，由下丘腦產生的血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）水平升高，作用于腎臟集合管主細胞AVPV2 受體，通過異三聚體G 蛋白(Gs 蛋白)激活膜內腺苷酸環化酶，使主細胞內cAMP 升高， 繼而激活胞質內蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，使AQP2 發生磷酸化并由胞漿囊泡向管腔膜轉移，通過胞吐作用融合并嵌入管腔膜，水通道開放，形成水潴留[2]。 前期臨床研究表明，臨床效方心康飲對慢性心衰合并利尿劑抵抗的患者具有良好效果［3］，現將該方制作成顆粒沖劑，觀察其對慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA的影響，進一步探討其抗心衰作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠70 只， 體質量180～220 g， 由湖南斯萊克景達實驗有限公司提供動物許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 藥物 鹽酸多柔比星，深圳萬樂藥業(批號：1206E5)； 芪藶強心膠囊， 石家莊以嶺藥業 （批號：123901）； 心康沖劑（黃芪30 g， 白參10 g， 陳皮10 g，茯苓15 g，桂枝6 g，制附片10 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，砂仁6 g），經湖南省中醫院藥劑科制成顆粒劑（15 g/包），每克相當于生藥3.38 g。

1.1.3 試劑 常規化學試劑由北京化學試劑公司提 供；Tris、Trizol、DEPC 均 由Sigma 提 供；SYBGREEN PCR Mix Mix、Taq 酶、 逆 轉 錄 試 劑 盒、DL1000 DNA Marker、dNTP 均 購 于Genstar；EDTA由Fermentas 提供；E.B.購買于ABI；水合氯醛由天津科密歐化學試劑公司提供。

1.1.4 儀器 旋渦混合器VORTEX-5、 搖床ZD-2008（江蘇海門其林貝爾儀器公司）；臺式冷凍離心機5417R (德國eppendorf 公司)； 熒光定量RCP 儀Thermo Scientific/ARL（美國Thermo 公司）；水平瓊脂糖電泳儀DYCP-34A（北京六一儀器廠）；電動玻璃勻漿器DY89-Ⅱ （寧波新芝科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 利用EXCEL 表格隨機數生成法抽取10 只大鼠為正常對照組， 其余大鼠造模成功后，分為模型對照組，心康沖劑低、中、高劑量組，芪藶強心組（對照組），每組各12 只。

1.2.2 造模方法 參考相關文獻[4-6]，除正常組外，其余各組使用鹽酸多柔比星腹腔注射法建立心衰動物模型2 mg/kg，每周1 次，共10 周，總劑量為20 mg/kg。預實驗建模結束后，處死大鼠速取心臟，投入10%甲醛溶液固定24 h， 石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.3 給藥方法 大鼠給藥劑量按等效體表面積折算[8]，心康沖劑等效（低）劑量組、2 倍等效（中）劑量組、4 倍等效（高）劑量組，給藥劑量分別為1.08、2.16、4.32 g/kg；對照組灌服芪藶強心膠囊，按等效劑量給藥濃度為0.06 g/kg；空白、模型對照組均灌服等體積蒸餾水。 以上各組均每天灌胃1 次，2 mL/次。

1.2.4 Real-time PCR 法檢測AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表達 第6 周實驗結束后， 各組隨機取存活大鼠6 只， 取下丘腦及腎臟，Trizol 法提取總RNA，以總RNA 為模板，逆轉錄得到cDNA。 操作步驟均按試劑盒說明書進行， 紫外分光光度計檢測RNA純度。 引物由上海生工提供。 以β-actin 為內參基因，引物序列參考相關文獻[9-10]，使用Primer primer5軟件設計完成，β-actin-F：5’- CATCCTGCGTCTGGACCTGG -3’，β -actin -R：5’ -TAATGTCACGCA GATTTCC-3’ 擴增片段長度107 bp，AQP2-F：5’-GGGACCTGGCGTCAATGCTC -3’AQP2 -R：5’ -GCTCGTCGGTGGAGGCAAAGAT-3’擴增片段長度114 bp，AVPV2-F：5’-CTGGCACCAGACTGGCGTGTAT-3’，AVPV2 -R：5’ -TGCTCAGCGTGATGTGGGAAAT-3’擴增片段長度182 bp，由上海生工合成提供。 PCR 反應體系為30 μL，包括上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR H2O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL， 擴增條件：預變性95 ℃10 min；變性95 ℃10 min；退火/延伸59 ℃50 s，共40 次循環。 采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 轉錄水平的相對表達。 Ct 為目的基因擴增到預定熒光信號強度所需要的循環數，ΔCt為目的基因Ct 與同一樣品action 的Ct 的差值，ΔΔCt 為目的樣品與空白組樣品ΔCt 之間的差，每一組都以空白組樣品為1，相對表達量=2-ΔΔCt，每一個樣品重復3個孔。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 光學顯微鏡下觀察心肌病理改變

與文獻報道[7]大致符合CHF，證明造模成功。 結果如圖1、2 所示，見封三彩圖。

2.1 RT-PCR 溶解曲線分析

結果顯示，各實驗組AQP2 和AVPV2 溶解曲線中均有單一的主峰，溶解溫度為84 ℃，相同擴增條件下重復多次，得到的AQP2 和AVPV2 溶解溫度均在 （84±1）℃， 說明擴增的為特異性產物。見圖3-4。

圖3 腎臟集合管主細胞AQP2 溶解曲線（n=3）

圖4 腎臟集合管主細胞AVPV2 溶解曲線（n=3）

2.2 AQP2 和AVPV2mRNA 表達的2-ΔΔCt 值

結果顯示， 心康沖劑可顯著抑制AQP2mRNA、AVPV2mRNA 在心力衰竭大鼠腎臟集合管主細胞的過度表達，從而減少水潴留。 見圖5-6。

圖5 腎臟集合管主細胞AQP2 擴增曲線（n=3）

圖6 腎臟集合管主細胞AVPV2 擴增曲線（n=3）

2.3 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較

與正常對照組相比， 模型組的AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比芪藶強心組、 心康沖劑各組AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）。 與 芪 藶 強 心 組 相 比， 心 康 沖 劑 各 組AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達下調更為明顯 （均P＜0.05）；心康沖劑各組間AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表達無明顯差異（P>0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比較（±s，n=6）

注：與對照組比較●P＜0.05；與模型組比較○P＜0.05；與芪藶強心組比較△P＜0.05。

組 別正常對照組模型對照組芪藶強心組心康低劑組心康中劑組心康高劑組藥物濃度(g/mL)— —0.06 1.08 2.16 4.32 AQP2mRNA 1.067±0.064 4.622±0.125●3.585±0.080●○2.313±0.090●○△2.359±0.066●○△2.393±0.079●○△AVPV2mRNA 1.202±0.084 5.444±0.414●3.789±0.362●○2.367±0.273●○△2.482±0.259●○△2.691±0.260●○△

3 討論

慢性心力衰竭（CHF）是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈和射血功能受損的一組復雜臨床綜合征，有典型的癥狀（即呼吸困難、疲乏）和液體潴留（肺淤血或外周水腫）[11]。利尿劑是唯一能充分控制和有效消除液體潴留的藥物， 但并不能維持長期的穩定臨床療效。 慢性心衰屬于中醫學 “胸痹”、“厥心痛”、“水腫”等范疇。 毛以林主任醫師通過長期臨床觀察發現其病機關鍵是宗氣下陷、脾腎陽虛、水濕內停，并制定出以升補宗氣、溫陽利水為基本治法的臨床效方心康沖劑。 方中大劑黃芪升補下陷之宗氣，白參補心肺之氣共為君藥，前者補中帶升，后者補氣雄厚；柴胡、升麻提升清陽之氣；桔梗為舟揖之藥，載諸藥上達而使藥至病所；茯苓、薏苡仁甘淡健脾利水；生姜皮、大腹皮專利肌膚之水；砂仁化濕運脾，陳皮理氣，因氣能行水化水；制附片溫補腎陽，桂枝溫陽化氣，諸藥和而為功。

在慢性心衰水潴留機制中，腎臟是水潴留的關鍵環節。 AQP2 主要位于腎臟集合管主細胞管腔側的囊泡內，是腎臟重吸收水分，濃縮尿液，調節機體水鈉平衡的關鍵蛋白，在慢性心衰水潴留中發揮重要作用[12]，主要體現在AQP2 通過調節插入集合管上皮細胞頂端膜上的數量來調節集合管對水的通透性，調控主要有短期調控與長期調控兩種方式[13]：一是AVP 與腎集合管主細胞V2 受體結合激活蛋白激酶A，使胞漿囊泡中的AQP2 發生磷酸化，觸發AQP2 向管腔膜轉移，融合嵌入管腔膜，致管腔膜上的AQP2 密度增加，水通道開放，水的通透性增加，此即短期調控的“穿梭機制”；二是AVP 水平持續升高可長期刺激主細胞促使AQP2 基因活化， 在轉錄水平使AQP2 增加，集合管AQP2 絕對數量增加，從而增加水的轉運能力[14-15]。 從而導致水鈉潴留，心臟容量負荷增加，加重心功能衰竭。

本研究發現心康沖劑能夠下調心衰大鼠腎臟AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表達， 這可能系該方臨床具有良好利尿效果，從而減少水潴留，改善心功能作用機制之一，值得進一步探索研究。

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