黃芪多糖與總黃酮抗小鼠四環素肝毒性的比較研究

姚曉敏，李 越，張小莉，李本勇，林愛斌，李宏偉

（1.浙江醫藥高等專科學校藥學系，浙江 寧波315100；2.北京市理化分析測試中心，北京100050；3.吉林省四平市中心醫院小兒外科，吉林 四平136000）

目前已知數以千計的藥物可引起肝毒性[1]，其表現與人類各種肝病的表現相同， 可以表現為肝細胞壞死、膽汁瘀積、細胞內微脂滴沉積或慢性肝炎、肝硬化等。 其中，四環素是引起肝毒性的藥物之一，可誘發小泡性脂肪肝。 臨床上根據患者是否飲酒將脂肪肝分為酒精性脂肪肝 （ALD） 和非酒精性脂肪肝（NAFLD），NAFLD 是無過量飲酒史（男性＜140 g 乙醇/周，女性＜70 g 乙醇/周）、肝組織學病變與ALD 相似的臨床綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和脂肪肝性肝硬化。 據報道，該病的患病率正在迅速上升， 已成為世界性公共衛生問題之一[2]。 對于脂肪肝的治療，尚無療效確切的藥物，尋找有效的藥物治療NAFLD 十分必要。中藥有著多靶點、多環節綜合作用的特點，在治療脂肪肝方面有著自身的優勢。 因此，本研究采用四環素建立小鼠肝毒性模型， 考察中藥黃芪主要有效組分多糖和總黃酮對NAFLD 的保護作用， 并比較二者對NAFLD 的保護作用，為黃芪的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR 小鼠50 只， 雄性， 體質量20～22 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術公司，動物許可證編號No.SCXK（京）2012-0001。 所有動物實驗期間飼養于北京實驗動物研究中心，即屏蔽級動物房，每日明暗室各12 h，恒溫恒濕，標準飼料，自由飲水。

1.2 藥物與試劑

鹽酸四環素（CAS：64-75-5）購自Ameresco 公司；谷丙轉氨酶（ALT）（貨號C009-2）、谷草轉氨酶（AST）（貨號C010-2）、甘油三酯（TG）（貨號F001-1）、膽固醇（CHO）（貨號F002-2）、丙二醛（MDA）（貨號A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）（貨號A001-1）和谷胱甘肽（GSH）（貨號A006-2）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；黃芪多糖和黃芪總黃酮均購自南京澤朗醫藥科技有限公司， 純度大于90%；聯苯雙酯滴丸（批號：13010104）購自北京市地壇醫院；其他試劑均為分析純化學試劑。

1.3 主要儀器

IKA T10 勻漿機（basic）；GD120-S12 加熱制冷水 浴 槽（Grant）；多 功 能 酶 標 儀（varianscan Flash，Thermo）；電子天平（LA5002，上海精天電子儀器公司）；PHS-3C 酸度計（上海精密科學儀器廠）；80i 電子顯微鏡（Nikon）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將ICR 小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為正常對照組、四環素模型組、黃芪多糖組、黃芪總黃酮組和聯苯雙酯陽性對照組。

1.4.2 給藥方法 黃芪多糖、總黃酮和聯苯雙酯分別采用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配成濃度分別為62.5、62.5、18.75 mg/mL 的溶液，給藥組分別按體質量給予黃芪多糖（500 mg/kg）、黃芪總黃酮（500 mg/kg）和聯苯雙酯（150 mg/kg），連續灌胃10 d， 正常組和模型組給予同體積0.5% CMC-Na溶液。

1.4.3 造模方法[3]在第10 天給藥后1 h 時腹腔注射四環素200 mg/kg， 對照組給予等體積生理鹽水。 給毒后24 h 眼球取血，并取肝臟進行檢測。

1.4.4 檢測指標 利用試劑盒，采用比色法測定小鼠血清ALT、AST、TG 和CHO 水平， 以及 肝組織TG、CHO、MDA、SOD 和GSH 水平；取肝組織經10%中性福爾馬林溶液固定后做病理切片。 酒精梯度脫水，常規石蠟包埋，連續切片（厚度約5 μm），經蘇木素-伊紅（HE）染色后，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學改變。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0 統計軟件處理分析數據， 采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗對各組同一時間點的同一指標進行比較，實驗數據以“±s”表示，P＜0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪多糖與總黃酮對四環素所致小鼠血清轉氨酶和血脂異常的影響

本研究給予小鼠腹腔注射四環素24 h 后血清ALT 和AST 顯著升高（P＜0.01），分別為正常對照組的4.4 和1.5 倍。 黃芪多糖和黃芪總黃酮預防性治療均能夠顯著抑制ALT 水平的升高（P＜0.01），但是對于AST 水平的變化，只有黃芪多糖能抑制其升高（P＜0.01）。

此外， 本實驗給予小鼠腹腔注射四環素24 h后， 還可見血清TG 和CHO 出現顯著下降 （P＜0.01），分別下降為對照組的39.5%和53.1%。而給予黃芪多糖預防性干預能明顯抑制小鼠血脂異常降低（P＜0.01，P＜0.05），但是黃芪總黃酮預防性治療對其血脂的變化無顯著影響。 見表1。

表1 黃芪對四環素所致小鼠血清轉氨酶和血脂改變的影響 （n=10，±s）

表1 黃芪對四環素所致小鼠血清轉氨酶和血脂改變的影響 （n=10，±s）

注： 與正常對照組比較**P＜0.01，***P＜0.001； 與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。 下表同。

組 別正常對照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯苯雙酯陽性對照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 ALT（U/L）10.89±3.38 48.08±8.91***18.59±5.70###22.71±8.69###14.22±4.06###AST（U/L）24.72±8.02 37.78±5.71**26.90±3.86##38.10±9.88 31.72±9.70 TG（mg/dl）105.32±13.35 41.59±9.49***71.92±20.17##34.79±10.35 92.51±28.19##CHO（mg/dl）198.26±33.46 105.33±25.82***144.71±21.77#132.31±30.23 117.93±16.26

2.2 黃芪多糖與總黃酮對四環素所致小鼠肝臟脂質蓄積的作用

給予小鼠腹腔注射四環素24 h 后， 肝臟出現明顯的TG 和CHO 蓄積（P＜0.01），分別為對照組的2.4 和1.3 倍。黃芪多糖和總黃酮均只能顯著減輕四環素引起的小鼠肝臟CHO 蓄積（P＜0.01）。 見表2。

表2 黃芪對四環素所致小鼠肝脂改變的影響（n=10，±s）

表2 黃芪對四環素所致小鼠肝脂改變的影響（n=10，±s）

組 別正常對照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯苯雙酯陽性對照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 TG（mmol/g）105.81±16.40 253.02±53.64***221.64±15.50 218.92±34.92 171.36±39.90#CHO（mmol/g）32.89±3.44 42.99±6.55**9.58±4.81##14.43±2.94###21.95±4.16###

2.3 黃芪多糖與總黃酮對四環素所致小鼠肝臟氧化損傷的作用

模型組腹腔注射四環素24 h 時肝勻漿MDA水平顯著升高為正常組的3.5 倍（P＜0.01）。 而黃芪多糖和總黃酮組對MDA 升高有抑制趨勢， 但無統計學意義（P＞0.05）。 模型組小鼠肝臟抗氧化酶SOD活性升高了10.8%，GSH 顯著升高了73.1%，黃芪總黃酮（500 mg/kg）可進一步顯著升高GSH 水平（P＜0.05），對抗氧化物SOD 活性影響不明顯。 而黃芪多糖只是有升高SOD 活性和GSH 水平趨勢， 但無統計學意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 黃芪對四環素所致小鼠肝組織MDA 形成和抗氧化物水平改變的影響 （n=10，±s）

表3 黃芪對四環素所致小鼠肝組織MDA 形成和抗氧化物水平改變的影響 （n=10，±s）

組 別正常對照組模型組黃芪多糖組黃芪總黃酮組聯苯雙酯陽性對照組劑量（mg/kg）— —500 500 150 MDA（nmol/mg）0.60±0.15 2.10±0.53***1.84±0.59 1.59±0.29 1.32±0.57#SOD（U/mg）89.01±15.05 98.65±5.75 98.92±6.41 96.83±5.19 82.87±4.41###GSH（mg/g）0.93±0.13 1.61±0.68*1.47±0.44 2.39±0.32#2.84±0.80#

2.4 黃芪多糖與總黃酮對四環素所致小鼠肝臟病理組織學改變的作用

ICR 小鼠腹腔注射四環素后24 h 取肝臟，經10%甲醛固定，石蠟包埋，HE 染色。光鏡下可見正常組小鼠肝組織結構正常，肝小葉、中央靜脈、匯管區結構清晰，肝細胞索排列整齊；模型組動物肝臟的中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現肝細胞腫脹、水樣變性、小泡性脂變等；黃芪多糖和總黃酮（500 mg/kg）可明顯減輕上述肝組織損傷、壞死和小泡性脂變程度，如圖1 所示，見封三彩圖。

3 討論

黃芪的主要化學成分是多糖、黃酮及皂苷。 藥用歷史悠久，應用廣泛。 黃芪在肝臟疾病的治療中顯現出很好的療效。 如在乙肝、肝損傷、脂肪肝和肝纖維化治療方面，黃芪注射液及黃芪復方湯藥都顯示出療效明顯的保肝作用[4-8]。 但是，黃芪注射液對脂肪肝的改善作用的有效組分，以及對藥物所致脂肪肝的作用和作用機制等尚不清。

本研究首先建立四環素誘導脂肪肝模型，即腹腔注射單劑量四環素（200 mg/kg）能夠引起小鼠肝臟脂肪變性，表現為血清轉氨酶ALT 和AST 明顯升高、 血脂TG 和CHO 顯著降低、 肝臟脂質TG 和CHO 聚積，以及肝細胞出現小泡性脂質聚集和水樣變性，上述結果均可反映出腹腔注射四環素引起小鼠發生脂肪肝的早期變化。 以往研究表明，過量四環素造成急性肝細胞脂肪變的原因之一是：抑制微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTP）活力，阻斷極低密度脂蛋白（VLDL）組裝，導致脂質不能以脂蛋白的形式運送出肝臟，引起TG 和CHO 分泌減少[9-10]，從而使血清TG 和CHO 下降， 而肝組織TG 和CHO 增多。而黃芪多糖可明顯降低升高的血清ALT 和AST 水平，抑制血清TG 和CHO 水平的下降，并降低肝臟脂質CHO 的聚集。 而黃芪總黃酮只抑制血清ALT和肝組織CHO 水平的異常升高， 對血清AST、TG、CHO 以及肝組織TG 無明顯作用。此外，黃芪多糖和總黃酮均可明顯改善四環素所致肝細胞腫脹、水樣變性和小泡性脂變等病理學改變。 從而提示，黃芪的這兩個組分均可明顯改善四環素所致小鼠肝組織脂肪變的發生，但是，黃芪總黃酮對四環素所致小鼠肝組織脂肪變性的作用明顯弱于多糖的作用。此結果與以往報道黃芪多糖的作用基本一致[11]，說明黃芪抗脂肪肝作用的最主要有效組分可能是多糖，其次是黃酮。

對于NAFLD 的發病機制，目前以Day[12]提出的“二次打擊學說”最為著名。 第一次打擊為各種原因導致的胰島素抵抗，游離脂肪酸（FFA）增加，肝臟脂肪代謝障礙， 從而使肝細胞內合成TG 增加而輸出減少，導致肝細胞脂肪變性。 第二次打擊是在第一次的基礎上，出現氧化應激和脂質過氧化，線粒體功能失調，呼吸鏈復合物活性降低等。 四環素是引起肝細胞脂肪變性的藥物之一，可誘發小泡性脂肪肝。過量ROS 生成或抗氧化物的缺失會導致細胞損傷[13]。丙二醛（MDA）是肝細胞內脂質過氧化終產物，其含量可以反映脂質過氧化程度。 而SOD 和GSH是體內防御氧化損傷的重要抗氧化物。 本研究結果顯示，小鼠腹腔注射四環素后肝組織脂質過氧化產物MDA 明顯增多， 抗氧化物GSH 含量出現升高，可考慮為抗氧化物的升高屬于代償性，以利于自由基清除。 而黃芪多糖和總黃酮預防給藥雖然沒有顯著地抑制MDA 增多， 但是二者預防給藥均有明顯升高GSH 和SOD 水平的趨勢， 尤其是總黃酮可進一步顯著升高肝組織GSH 水平。 由此推測，黃芪多糖和總黃酮抗四環素所致小鼠肝細胞脂肪變性的機制可能與其抗氧化作用相關。

綜上所述，單劑量腹腔注射四環素可引起小鼠肝組織出現明顯的脂肪變性，其發生機制與氧化應激有關。 黃芪多糖和總黃酮預防給藥對四環素引起肝細胞脂肪變性均顯示出不同程度的保護作用，黃芪多糖作用明顯強于總黃酮，與其抗氧化作用密切相關，其作用的最主要有效組分是多糖，其次是總黃酮。 此研究將為NAFLD 的臨床治療，以及進一步開發黃芪有效組分為保肝降脂藥的應用提供科學的實驗依據。

致謝：本實驗過程中動物飼養于北京實驗動物研究中心，感謝北京實驗動物研究中心對本實驗的完成所提供的所有幫助！

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