廣西壯族、漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡與Toll樣受體9基因多態(tài)性研究

溫斯健 吳飛云 林有坤 方玲

廣西壯族、漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡與Toll樣受體9基因多態(tài)性研究

溫斯健 吳飛云 林有坤 方玲

目的探討TLR9單核苷酸多態(tài)性與廣西系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者發(fā)病的相關(guān)性,以及其在壯族、漢兩個(gè)民族間的差異。方法聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)對(duì)97例廣西SLE患者和202例廣西健康對(duì)照者的TLR9基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),分析其基因型和等位基因頻率與SLE部分臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性,并比較兩民族間的差異。結(jié)果TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型頻率在漢族SLE組與漢族對(duì)照組中分別為42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其C、T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型頻率和等位基因頻率在壯族SLE組與壯族健康對(duì)照組間、壯族SLE組與漢族SLE組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率在ds-DNA陽(yáng)性組比陰性組高(P＜0.05),而T等位基因頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率和T等位基因的頻率在SLEDAI≥9組比SLEDAI＜9組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。TLR9 rs352140TT基因型頻率和T等位基因的頻率在ANA陽(yáng)性組與陰性組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。結(jié)論TLR9 rs352140基因多態(tài)性可能與廣西漢族人SLE的易感性有關(guān),TLR9基因多態(tài)性與部分SLE指標(biāo)可能具有相關(guān)性。

紅斑狼瘡,系統(tǒng)性;Toll樣受體9;多態(tài)性,單核苷酸;壯族;漢族

作者單位:530021南寧,廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科(溫斯健、吳飛云、林有坤);廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室(方玲)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病,發(fā)病機(jī)制迄今不明,免疫和遺傳在其發(fā)病中都起了重要作用[1]。隨著Toll樣受體(TLR)家族的發(fā)現(xiàn),天然免疫在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受重視[2]。TLR與配體結(jié)合后激活天然免疫進(jìn)而獲得特異性免疫,在兩者之間起橋梁作用,并參與免疫缺陷性疾病、異常免疫應(yīng)答性疾病等的發(fā)病[3]。TLR9由于特異性識(shí)別非甲基化的CpG-DNA序列,在自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[4]。本研究探討TLR9分子單核苷酸多態(tài)性與廣西SLE發(fā)病的相關(guān)性并比較兩民族間的差異。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2010年5月至2013年1月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科住院的SLE患者97例,其中壯族41例,男5例,女36例,年齡11～60歲,平均(34.1±10.7)歲;漢族56例,男6例,女50例,年齡9～72歲,平均(34.4±12.2)歲。所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],首次診斷而住院,入院前從未用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等,未合并其他結(jié)締組織病、腫瘤、糖尿病等系統(tǒng)性疾病。對(duì)照組202例為同期在本院健康體檢者。其中壯族82例,男8例,女74例,年齡15～60歲,平均(33.1±10.1)歲;漢族120例,男15例,女105例,年齡12～68歲,平均(36.6±10.8)歲。以上均為廣西籍人且3代內(nèi)均為純壯族或漢族血統(tǒng),相互間無(wú)親緣關(guān)系。各組間在性別、年齡比例上均衡可比(均P＞0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),均簽署知情同意書。

二、方法

1.標(biāo)本采集及基因組DNA提取:采集各對(duì)象外周靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管中,按DP1802全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型,帶蛋白酶K,北京Bioteke公司)說(shuō)明書提取白細(xì)胞基因組DNA,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.引物設(shè)計(jì):參照GenBank中TLR9基因的引物序列運(yùn)用primer5.0設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物的核苷酸序列上游引物5'-AAAGAAGGCCAGGTAATTGTCA-3';下游引物5'-TGCTAGACCTGTCCCACAATAA-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度431 bp,引物的退火溫度為58℃。PCR反應(yīng):按照BioTeke的2×Power Taq PCR MasterMix試劑盒說(shuō)明書操作。PCR反應(yīng)體系如下:2×MasterMix 25 μl,上、下游引物各 2 μl,模板 6 μl,補(bǔ)雙蒸水15 μl至總體積50 μl。在德國(guó)Biometra公司梯度PCR儀進(jìn)行循環(huán),反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性95℃3min;變性95℃ 30 s;退火58℃ 30 s;延伸72℃ 45 s,總共35個(gè)循環(huán),最后延伸72℃ 10min。

3.限制性酶切反應(yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析:用限制性核酸內(nèi)切酶Bsh1236I(BstUI)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系如下:無(wú)核酸酶水9 μl,10 × 緩沖液 1 μl,Bsh1236I 1 μl,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μl。輕輕混勻并置于37℃恒溫水浴箱中酶切至少4 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)凝膠成像結(jié)果,隨機(jī)抽取酶切成1、2、3條條帶的樣本各10個(gè),將其PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果回報(bào)后使用Chromas軟件打開(kāi)DNA序列并讀取和記錄。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)算各組基因型和等位基因頻率,數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件包,然后確認(rèn)其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)和校正χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

TLR9基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖,可見(jiàn)到明亮的、單一的431 bp的目的基因條帶,沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,見(jiàn)圖1。

圖1 TLR9基因PCR產(chǎn)物電泳圖1～4,6～8:DNA PCR 431 bp目的條帶;5:空白對(duì)照;M:標(biāo)準(zhǔn)參照物

二、PCR產(chǎn)物的限制性酶切的電泳結(jié)果

根據(jù)酶切圖譜知限制性核酸內(nèi)切酶Bsh1236I(BstUI) 特異酶切序列為5'…CGCG…3'和3'…GCGC…5'。TLR9 rs352140存在多態(tài)性,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切后:CC基因型可以被Bsh1236I(BstUI)酶切,產(chǎn)生371 bp和60 bp 2條帶;TT基因型不能被酶切,只有431 bp 1條帶;CT雜合子可見(jiàn)431 bp、371 bp和60 bp 3條帶。TLR9 rs352140酶切產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2。

圖2 TLR9rs352140 C/T酶切圖譜 1、6、8:CC 基因型;3、5、7、10:CT基因型;9:TT基因型;2;空白對(duì)照組;4:標(biāo)準(zhǔn)參照物

三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

TLR9 rs352140C/C、C/T、T/T 基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖分別見(jiàn)圖3～5。

圖3 TLR9rs352140C/C基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖(下劃線為C等位基因)

圖4 TLR9rs352140C/T基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖(下劃線為C/T雜合子)

圖5 TLR9rs352140T/T基因型擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖(下劃線為T等位基因)

四、TLR9rs352140C/T多態(tài)性與廣西壯族、漢族SLE的相關(guān)性分析

經(jīng)卡方檢驗(yàn),SLE組和對(duì)照組TLR-9基因rs352140C/T等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,說(shuō)明群體基因遺傳平衡,數(shù)據(jù)來(lái)自同一蒙德?tīng)柸后w(P＞0.05)。從表1可以看到,TLR9rs352140基因型及等位基因頻率在SLE組與對(duì)照組間,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。進(jìn)一步按壯族、漢族進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140CC、CT、TT基因型頻率在漢族SLE組與漢族對(duì)照組中分別為42.9%、41.1%、16.1%和38.3%、55.8%、5.8%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044),其C、T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TLR9rs352140 C/T基因型頻率和等位基因頻率在壯族SLE組與壯族對(duì)照組間、壯族SLE組與漢族SLE組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05),見(jiàn)表2。

表1 TLR9rs352140基因型及等位基因頻率與廣西SLE組及對(duì)照組的差異性比較分析[例(%)]

表2 TLR9rs352140C/T基因型及等位基因頻率與廣西壯族、漢族SLE的相關(guān)性分析[例(%)]

五、TLR9 rs352140 C/T多態(tài)性位點(diǎn)與廣西SLE患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較分析

表3 TLR9 rs352140C/T多態(tài)性位點(diǎn)與廣西SLE部分指標(biāo)的比較分析[例(%)]

表3顯示了TLR9 rs352140的基因型頻率和等位基因頻率與97例SLE患者按ds-DNA陽(yáng)性與陰性、ANA陽(yáng)性與陰性、SLEDAI≥9分與＜9進(jìn)行分組后的比較分析情況。在校正了性別、年齡等混雜因素后,χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示,TLR9 rs352140 TT基因型頻率在ds-DNA陽(yáng)性組比陰性組高(P＜0.05),而T等位基因頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型頻率和T等位基因的頻率在SLEDAI≥9組比SLEDAI＜9組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。TLR9 rs352140 TT基因型頻率和T等位基因的頻率在ANA陽(yáng)性組與ANA陰性組間,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

討 論

近年來(lái)研究表明,TLR9在天然免疫和體內(nèi)抗體的形成中起重要作用。Ichikawa等[6]研究表明,TLR9可以與細(xì)菌CpG基序結(jié)合,進(jìn)而激活抗原提呈細(xì)胞識(shí)別細(xì)菌和自身抗原,打破自身免疫耐受。最近有研究表明,不僅病原微生物的CpG DNA可以被TLR9識(shí)別,而且哺乳動(dòng)物本身的內(nèi)源性配體,即低甲基化核酸序列也可以被TLR9識(shí)別。SLE患者的DNA甲基化酶活性降低,引起DNA低甲基化增多,同時(shí)還因?yàn)榛颊呒?xì)胞凋亡增加,從而使患者血清中低甲基化的DNA升高。這些低甲基化的DNA就可以與TLR9結(jié)合,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗dsDNA抗體。劉慧敏等[7]研究發(fā)現(xiàn),抗dsDNA抗體的產(chǎn)生需TLR9參與,用氯喹阻斷TLR9 CpG DNA信號(hào)傳導(dǎo)路徑后,抗dsDNA抗體的產(chǎn)生明顯下降。

TLR9存在基因多態(tài)性。宋衛(wèi)青等[8]報(bào)道,TLR9 rs187084C/T基因型頻率和等位基因頻率與漢族人群SLE無(wú)關(guān),但發(fā)現(xiàn)TLR9基因表達(dá)增高。Xu等[9]發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140的多態(tài)性可能與SLE的易感性有關(guān)。日本[10]、丹麥[11]等學(xué)者發(fā)現(xiàn),TLR9多個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與SLE易感性有關(guān),TT基因型頻率在SLE組較正常組高。本研究發(fā)現(xiàn),TLR9 rs352140基因多態(tài)性在漢族SLE患者與漢族健康對(duì)照者間存在差異,TT基因型頻率在漢族SLE患者比漢族健康對(duì)照者高,但在壯族、漢族SLE患者間,壯族SLE患者與壯族健康者間,以及壯族、漢族正常人之間不存在差異,提示TLR9 rs352140TT基因型有可能是廣西漢族SLE的危險(xiǎn)基因型,與上述研究結(jié)果類似。研究還顯示,SLE組中TLR9 rs352140TT基因型頻率和(或)T等位基因頻率與抗dsDNA抗體陽(yáng)性、SLEDAI等SLE活動(dòng)指標(biāo)之間存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)性,提示TLR9有可能介導(dǎo)SLE疾病活動(dòng)性。人TLR9基因位于第3號(hào)染色體(3p21.3)上,含有兩個(gè)外顯子,第2個(gè)外顯子為主要編碼區(qū)域,rs352140位點(diǎn)就位于第2個(gè)外顯子上,該位點(diǎn)突變可能會(huì)增強(qiáng)TLR9的表達(dá)和功能,并通過(guò)其連鎖基因增強(qiáng)基因表達(dá)而增加SLE易感性,使得dsDNA抗體的產(chǎn)生增加,并進(jìn)一步影響SLE的活動(dòng)度。但這種相關(guān)性是否僅由漢族患者所引起,由于病例數(shù)偏少未能分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析而未能明確。

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2013-11-26)

(本文編輯:吳曉初)

Associations between Toll-like receptor 9 gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus in Guangxi Zhuang and Han populations

Wen Sijian*,Wu Feiyun,Lin Youkun,Fang Ling.*Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

Lin Youkun,Email:linyoukun7@aliyun.com

ObjectiveTo assess the association between Toll-like receptor 9(TLR9)gene single nucleotide polymorphisms(SNPs)and systemic lupus erythematosus(SLE)development in Guangxi Zhuang and Han populations,as well as the difference in TLR9 SNPs between the two populations.MethodsTotally,41 SLE patients of Zhuang nationality and 56 of Han nationality,as well as 82 healthy checkup examinees of Zhuang nationality and 120 of Han nationality were enrolled in this study.Venous blood samples were obtained from all of these subjects and subjected to DNA extraction.The single nucleotide polymorphisms in TLR9 gene were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)analysis followed by direct sequencing.Chi-square test and adjusted Chi-square test were conducted to assess the relationship between the genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs and some clinical and laboratory parameters of patients with SLE,as well as the differences in genotype and allele frequencies of TLR9 SNPs between the two populations.ResultsThe frequencies of CC,CT and TT genotypes of TLR9 SNP rs352140 were 42.9%,41.1%and 16.1%respectively in the patients of Han nationality,compared to 38.3%,55.8%and 5.8%in the healthy controls of Han nationality(allP＜0.05),but no significant difference was observed in the frequency of C or T allele of the SNP rs352140 between the patients and controls of Han nationality(bothP＞0.05).There was no significant difference in the genotype or allele frequency of TLR9 SNP rs352140 between the patients and healthy controls of Zhuang nationality,or between the patients of Han nationality and Zhuang nationality(allP＞0.05).The patients with anti-dsDNA antibodies showed a significantly higher frequency of TT genotype(P＜0.05),but similar T allele frequency at TLR9 SNP rs352140(P＞0.05)compared with those without.The frequencies of both TT genotype and T allele of TLR9 SNP rs352140 were significantly increased in the patients with a SLE disease activity index(SLEDAI)≥9 compared with those with a SLEDAI＜9(bothP＜0.05).There was no statistical difference in either the TT genotype or the T allele frequency at TLR9 SNP rs352140 between antinuclear antibody-positive and-negative patients with SLE(bothP＞0.05).ConclusionsThe TLR9 SNP rs352140 is correlated with several clinical and laboratory parameters of SLE,and might contribute to the susceptibility to SLE in Guangxi Han population.

Lupus erythematosus,systemic;Toll-like receptor 9;Polymorphism,single nucleotide;Zhuang nationality;Han nationality

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.008

廣西自然科學(xué)基金(2010GXNSFA013186)

林有坤,Email:linyoukun7@aliyun.com