MBP促進出血性卒中大鼠康復的作用機制研究

袁 宇，郭 毅，李春暉，史彥芳，胡福廣

(1.河北大學附屬醫院，河北保定071000;2.河北醫科大學第二醫院，河北石家莊050000)

出血性卒中占全部腦卒中的20%～30%，病死率和致殘率高，是危害人類健康的主要疾病之一。在全球，每年有數千萬人罹患出血性卒中，其中35%～52%的病例在1個月內死亡，病情加重的主要原因是出血后的繼發性腦損害，因此如何阻斷繼發性腦損害的發生成為人們關注的熱點。免疫系統在損害擴散過程中的作用一直存有爭議，一方面抗炎性化合物，如甲基潑尼松龍在創傷后早期階段具有對抗損傷蔓延的作用;另一方面炎性細胞(巨噬細胞)又是損傷神經纖維修復所需要的。此前研究證實，髓鞘堿性蛋白(MBP)免疫治療對缺血性腦損傷、創傷性腦損傷均有保護作用［1］。本研究應用大鼠出血性卒中模型，通過觀察腦組織中膠質纖維酸性蛋白(GFAP)與腦源性神經營養因子(BDNF)的免疫組化表達和脾臟中Foxp3 mRNA的表達，探討MBP免疫治療對出血性卒中后中樞神經系統創傷的神經保護作用機制。

1 實驗資料

1.1 實驗動物和分組 健康成年雌性SD大鼠(動物由河北醫科大學實驗動物中心提供，自然晝夜節律，自由飲水和標準飼料喂養)60只，體質量(300±20)g。采用隨機數字表分為MBP組、卵白蛋白(OVA)組、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)組各20只。根據干預時間點的不同，每組分為5個亞組，每組4只大鼠。1.2 試劑和儀器 MBP抗原、OVA抗原、不完全弗式佐劑(IFA)購自Sigma公司;逆轉錄酶(AMV-RT)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、瓊脂糖(agarose)及 Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)由Promega公司提供。GFAP兔抗大鼠多克隆抗體及BDNF兔抗大鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司。目的基因Foxp3的引物合成序列根據Poussier等［2］的方法設計，Foxp3引物序列:上游引物為5’-TGCATCAGCTCTCCACTGTAGACGCA-3’，下游引物為 5’-CGCTCAGGTACACCCAGGAAAGACAG-3’，大鼠 β-actin引物序列:上游為5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，下游為5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’，上海生物工程公司合成。NARISHIGE SR-6N型腦立體定向儀(日本)，GeneAmp 9600型PCR儀(美國PE公司)。

1.3 大鼠腦出血模型的制備 按照張祥建等［3］大鼠自體動脈血腦出血造模方法建立模型。

1.4 行為學評分 參照Longa五級評分法進行神經功能缺損評分。0級:無體征，記0分;Ⅰ級:動物不能完全伸直其前肢，計1分;Ⅱ級:動物一側肢體癱瘓，有追尾現象，計2分;Ⅲ級:動物不能站立、打滾，計3分;Ⅳ級:無自發性活動，有意識障礙，計4分［4］。造模成功12 h后，評分為2分大鼠入組。每天進行行為學評分。

1.5 主動免疫 腦出血模型建立后12 h，分別取IFA乳化的MBP、VOA、PBS于大鼠右下肢皮下注射，用量MBP 300μg/只，VOA 200 μg/只，PBS 200 μg/只。

1.6 標本取材 免疫后1，3，7，14，21 d對各組動物取材。10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉。胸腹腔聯合切開，摘除脾臟，置凍存管中-80℃液氮保存。斷頭取腦，石蠟包埋，4μm連續冠狀切片，取3張連片，分別做GFAP、BDNF免疫組織化學反應和HE染色。

1.7 RT-PCR法檢測Foxp3 mRNA 取脾臟組織100 mg，提取總RNA，-80℃保存備用。檢測提取RNA完整性，目的基因PCR擴增，同時擴增鼠β-actin用作內參照，RT-PCR產物半定量分析，計算Foxp3與β-actin的相對密度值，以此代表目的片斷相對表達值。

1.8 GFAP、BDNF免疫組化觀察 分別按操作說明進行，結果以胞漿清晰、棕色著色顆粒為陽性，細胞無棕色染色顆粒為陰性。采用計算機圖像分析系統進行定量分析，測定陽性反應物灰度值和陽性細胞的百分數，標準如下:A為陽性細胞數分級，0～1%=0，＞1%～10%=1，＞10%～50%=2，＞50%～80%=3，＞80%～100%=4，B為陽性細胞顯色強度分級，0為陰性、1為弱陽性、2為陽性、3為強陽性，免疫組化評分(HIS)=A×B。

2 結 果

2.1 模型建立成功 在注射自體動脈血液后，大鼠迅速出現行為和功能異常，表現為反應遲鈍，精神萎靡，飲食下降，皮毛欠光澤，一側肢體不同程度的癱瘓，追尾現象明顯，嚴重者動物不能站立、打滾，個別動物出現意識障礙，其功能異常程度與病變嚴重程度一致。腦組織標本可見明顯的血腫占位，提示模型建立成功。

2.2 行為學評分 MBP組Longa行為學評分顯著低于OVA組和PBS組，見表1。

表1 3組間Longa行為學評分比較(±s，分)

表1 3組間Longa行為學評分比較(±s，分)

注:①與MBP組比較，P＜0.05。

OVA組 2.16±0.22① 2.67±0.18① 1.31±0.42① 0.87±0.16①0.00±0.0

2.3 免疫組化

2.3.1 GFAP的免疫組化結果 在光鏡下，MBP組和PBS組大鼠在腦出血后，腦組織血腫周圍即可見GFAP表達，染色較均勻，結構完整的GFAP陽性星形膠質細胞呈蜘蛛樣，胞體肥大，胞漿呈顆粒狀、增粗，血腫周邊區表達明顯，見圖1及圖2。大鼠腦組織GFAP陽性細胞免疫組化評分看，MBP組明顯高于PBS組及OVA組(P均＜0.01)，PBS組和OVA組比較無顯著性差異，見表2。

圖1 MBP組腦出血大鼠治療后GFAP的表達(×400)

2.3.2 BDNF的免疫組化結果 在光鏡下，MBP組和PBS組大鼠腦出血后腦組織血腫周圍即可見BDNF胞漿棕染的陽性細胞，免疫陽性細胞可見神經元細胞和膠質細胞，見圖3及圖4。大鼠腦組織BDNF陽性細胞免疫組化評分，MBP組明顯高于OVA組及PBS組比較有顯著性差異(P均＜0.05)，PBS組和OVA組比較無顯著性差異，見表3。

圖2 PBS組腦出血大鼠治療后GFAP的表達(×400)

表2 3組出血周圍腦組織中GFAP的表達情況(±s)

表2 3組出血周圍腦組織中GFAP的表達情況(±s)

注:①與MBP組比較，P＜0.01。

?

圖3 MBP組腦出血大鼠治療后BDNF的表達(×400)

圖4 PBS組大鼠腦出血治療后BDNF的表達(×400)

表3 3組出血周圍腦組織中BDNF的表達情況(±s)

表3 3組出血周圍腦組織中BDNF的表達情況(±s)

注:①與MBP組比較，P＜0.05。

?

2.4 Foxp3 mRNA的表達 MBP組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達在1 d、3 d、7 d、14 d明顯低于PBS組和OVA組(P均＜0.01)，且在7 d時表達最低，在21 d時MBP組與對照組數值較接近，但仍有顯著性差異(P＜0.05)。PBS組和OVA組比較無顯著性差異。見圖5、圖6及表4。

圖5 MBP組大鼠脾臟T細胞Foxp3 mRNA電泳圖

圖6 PBS組大鼠脾臟T細胞Foxp3 mRNA電泳圖

表4 3組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達情況(±s)

表4 3組大鼠脾臟中Foxp3 mRNA的表達情況(±s)

注:①與BMP組比較，P＜0.01。

組別1d 3d 7d 14d 21d MBP組 0.454±0.08 0.273±0.05 0.146±0.06 0.462±0.03 0.537±0.06 PBS組 0.736±0.09① 0.674±0.11① 0.619±0.04① 0.586±0.06① 0.651±0.05①OVA組 0.695±0.06① 0.643±0.05① 0.705±0.09① 0.601±0.11① 0.565±0.06①

3 討 論

腦損傷后積極進行神經保護治療，對于減輕患者癥狀、降低病死率與致殘率都有著重要意義［5］。對于出血性卒中，中醫治療可以采用辨證論治、通腑瀉熱、宜通臟腑、通利九竅等治療［6］，西醫臨床上除運用傳統手術、脫水藥物及神經營養等藥物外，治療手段較少。本研究試圖應用MBP主動免疫實驗性腦出血大鼠，以探討免疫學方法在治療腦出血中的應用價值。

大鼠在對抗中樞神經系統中有鞘軸突損傷的能力，來源于T細胞介導的保護性自身免疫能力，該能力被有髓特異性T細胞所提呈。當應用MBP去免疫出生動物時，會導致其在成年時不會發生對髓鞘蛋白的保護性免疫反應，致使損傷相比普通動物重。MBP是神經髓鞘的一種特有膜蛋白，在顱內神經系統損傷累及髓鞘時可在腦脊液及血清中檢出。Kipnis［7］研究發現，MBP可提高視神經損傷后殘余神經元的免疫作用，證實了MBP自身免疫對中樞神經的免疫保護作用，對于MBP反應的T細胞過激轉移或用髓磷脂有關抗原主動免疫，通過保護損傷灶外周的神經細胞，可以促進中樞神經損傷的恢復。

在腦組織中的GFAP為神經膠質纖維所特有的一種中間絲蛋白，是星形膠質細胞特異性標記物，GFAP作為一種細胞骨架，具有一定的對抗損傷作用。本研究發現在相應的時間點，MBP組大鼠腦組織中GFAP的表達明顯高于OVA組及PBS組。BDNF在成熟的神經系統內，也是神經元執行正常功能和維持活性所必需的，其可通過為損傷神經元提供營養而促進中樞神經損傷后的運動和感覺神經元的恢復。本研究中觀察到，3組在腦出血后血腫周圍可見零星的BDNF陽性細胞，BDNF陽性細胞的密度和染色深度均較其他側高，陽性細胞的形態不規則，呈圓形或橢圓形，未見突起，胞漿淺棕色，腦出血后，血腫區內出現呈弱陽性的吞噬細胞，血腫周圍細胞免疫反應增強。MBP組在相應時間BDNF的表達高于OVA組及PBS組。結合各組腦出血大鼠行為學的觀察對比，表現出了MBP對出血性卒中的腦保護作用。

Foxp3是義頭樣轉錄因子家族中的成員，其表達及功能與調節性CD4+CD25+Treg細胞密切相關，在信使RNA及蛋白水平表達Foxp3陽性的CD4+CD25+Treg細胞，其數量的增減與對機體的免疫抑制功能提高和減退呈現相關性［8］。作為一個特異CD4+CD25+Treg細胞表面分子標記物的Foxp3，通過監測其變化就能反映CD4+CD25+Treg抑制功能改變。最近研究表明，去除了天然CD4+CD25+Treg(含總數10%的CD4+)，導致動物造成易患器官特殊性免疫疾病的因素［9］。通常自身免疫是被自然存在的調節性CD4+CD25+Treg細胞所抑制的，如果減弱了對有可能的神經元退變起保護作用的自身免疫抑制，那么受損的中樞神經的神經元就會受到保護［10］，也就是說，CD4+CD25+Treg的缺失促進中樞神經損傷后神經元的存活。在多發性硬化綜合征(MS)和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中，其發病機制都是由于對自身反應性抗原MBP等過激的免疫性損傷造成的，而在中樞神經損傷后，針對MBP適度的免疫反應，其結果就是免疫保護作用，二者具有極相近的免疫反應機制［11］。本實驗中MBP組大鼠脾臟的Foxp3 mRNA表達較PBS組及OVA組顯著減低，表現出了MBP對CD4+CD25+Treg的抑制作用，從而對神經元的退變起到了保護作用。

本研究顯示，MBP組大鼠的行為學評分較PBS組及OVA組低，腦組織內GFAP和BDNF免疫組化表達較PBS組及OVA組顯著增強，大鼠脾臟的Foxp3 mRNA表達較PBS組及OVA組顯著減低，提示MBP作為自身蛋白在主動免疫大鼠后起到了保護作用。其免疫保護作用機制為通過下調CD4+CD25+Treg細胞對效應細胞的抑制作用，使效應細胞作用上調，最終使星形膠質細胞的活性增強，表達GFAP和BDNF增強，從而促進出血性卒中大鼠的受損腦組織的康復。

［1］Kipnis J，Mizrahi T，Hauben E.Neuroprotective autoimmunity:naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells suppress the ability to withstand injury to the central nervous system［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24):15620-15625

［2］Poussier P，Ning T，Murphy T，etal.Impaired post-thymic development of regulatory CD4+25+T cells contributes to diabetes pathogenesis in BB rats［J］.Immunology，2005，174(7):4081-4089

［3］張祥建，劉春燕，祝春華，等.大鼠自體血腦出血動物模型的建立［J］. 腦與神經疾病雜志，2003，11(6):341-344

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without eraniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20(11):84-91

［5］胡福廣，張皓峰，范振增.中樞神經系統損傷與自身免疫神經保護的生理特性［J］.腦與神經疾病雜志，2009，17(2):107-110

［6］楊興勇.出血性腦卒中急性期的中醫治療［J］.現代中西醫結合雜志，2009，18(15):1773-1774

［7］Kipnis J.Myelin specific Th1 cells are necessary for post-traumatic protective autoimmunity［J］.Journal of Neuroimmunology，2002，130(1):78-85

［8］Kawamoto N，Ohnishi H，Kondo N，etal.The role of dendritic cells in the generation of CD4(+)CD25(HI)Foxp3(+)T cells induced by amino acid copolymers［J］.Strominger International Immunology，2013，25(1):53-65

［9］Sellebjerg F，Krakauer M，Khademi M，etal.FOXP3，CBLB and ITCH gene expression and cytotoxic T lymphocyte antigen 4 expression on CD4(+)CD25(high)T cells in multiple sclerosis［J］.Clinical and Experimental Immunology，2012，170(2):149-155

［10］G?bel K，Bittner N，Melzer N，etal.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+)effector T cells:implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level［J］.Journal of Neuroinflammation，2012，9(2):41-43

［11］Fissolo N，Costa C，Nurtdinov，etal.Treatment with MOG-DNA vaccines induces CD4+CD25+FoxP3+regulatory T cells and upregulates genes with neuroprotective functions in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Journal of Neuroinflammation，2012，9:139