IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響

范雙莉，任亞麗

(濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濟(jì)源459000)

幽門括約肌是幽門環(huán)形肌在幽門處明顯增厚形成的，能夠控制食物在胃內(nèi)消化停留的時(shí)間以及排往十二指腸的速度，從而防止胃排空過快，拮抗十二指腸胃反流。這一作用主要是依賴幽門括約肌的持續(xù)張力產(chǎn)生的靜息壓和周期性收縮產(chǎn)生的收縮壓來實(shí)現(xiàn)和維持的。幽門括約肌的收縮活動(dòng)主要依賴細(xì)胞內(nèi)Ca2+的介導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)由細(xì)胞膜鈣通道、鈣泵、肌漿網(wǎng)的鈣攝取和釋放以及Na+－Ca2+交換體的參與。文獻(xiàn)報(bào)道，IL－1β可通過上皮依賴機(jī)制舒張雜種狗支氣管平滑肌［1］，其還可通過調(diào)節(jié)NO信號(hào)途徑，劑量和時(shí)間依賴性抑制大鼠血管平滑肌收縮，IL－1β抑制平滑肌收縮的作用與NO信號(hào)途徑有關(guān)。IL－1β能否抑制幽門括約肌的自發(fā)收縮，目前尚少見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響，初步探討其作用機(jī)制，為IL－1β在平滑肌舒張方面的作用機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)充，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 主要試劑與儀器 IL－1β，ProSpec;亞甲基藍(lán)，Amresco;L－NAME，Sigma。RM6240B/C生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠;換能器，成都儀器廠;恒溫浴槽，成都儀器廠;灌流槽，成都儀器廠;倒置解剖顯微鏡，LeicaDMIL。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年SD大鼠80只(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(豫)(2010－0002))，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不拘。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠離體幽門括約肌標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)頸椎脫臼快速處死，打開腹腔，暴露胃底，分離幽門周圍組織，立即離體幽門括約肌，放入有Krebs液的培養(yǎng)皿中洗去內(nèi)容物。在解剖顯微鏡下清除周圍組織，制備成幽門括約肌條，長(zhǎng)10 mm、寬2 mm［2］。在肌條兩端分別穿雙股棉線，一端棉線懸掛于不銹鋼鉤，固定在灌流槽的底部，另一端棉線與張力換能器相連，連接到RM6240C型生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄張力－效應(yīng)曲線。根據(jù)長(zhǎng)度－張力曲線，給予1 g前負(fù)荷，使肌條拉伸至最適長(zhǎng)度。標(biāo)本在灌流槽中穩(wěn)定40 min，10 min換Krebs液1次，肌條出現(xiàn)自發(fā)收縮，觀察自發(fā)收縮曲線，待標(biāo)本活動(dòng)穩(wěn)定后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，肌條所在溶液中持續(xù)供應(yīng)95%O2和5%CO2的混合氣體，同時(shí)，灌流槽內(nèi)溫度維持在37℃。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 標(biāo)本分為正常組、IL－1β組、亞甲基藍(lán)組、L－NAME組。

1.3.2.1 正常組實(shí)驗(yàn)處理 離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，持續(xù)記錄張力－效應(yīng)曲線，觀察無任何處理時(shí)幽門括約肌的收縮振幅、頻率、張力的變化。

1.3.2.2 IL－1β組實(shí)驗(yàn)處理 離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，自發(fā)收縮基本平穩(wěn)，分別加入終濃度為2，20，200μg/L的IL－1β溶液，觀察不同濃度的IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，記錄濃度－效應(yīng)曲線。IL－1β作用60 min后，Krebs液沖洗標(biāo)本3次，每次10 min，直至標(biāo)本自發(fā)收縮回復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)。

1.3.2.3 亞甲基藍(lán)組和L－NAME組實(shí)驗(yàn)處理 2組離體肌條在灌流槽中穩(wěn)定40 min后，分別加入終濃度為2×10－6mol/L的亞甲基藍(lán)、100×10－6mol/L的 L－NAME，孵育 30 min，每組中分別加入終濃度為2，20，200μg/L的 IL－1β 溶液，記錄各組張力－效應(yīng)曲線60 min。觀察不同藥物孵育后，IL－1β對(duì)離體幽門括約肌自發(fā)收縮的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Krebs液沖洗標(biāo)本3次，每次10 min，直至肌條回復(fù)至穩(wěn)定水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 IL－1β的效應(yīng)曲線由RM6240C型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)獲得，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，t’檢驗(yàn)進(jìn)行組間、組內(nèi)的顯著性差異比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮情況 大鼠離體幽門括約肌肌條在浴槽中平衡一段時(shí)間后，肌條開始出現(xiàn)自發(fā)收縮，將無自發(fā)收縮波或自發(fā)收縮張力較小(＜1 g)的標(biāo)本舍棄，持續(xù)記錄大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮曲線60 min，見圖1，其收縮的振幅為(0.44±0.01)g，頻率為(3.91±0.08)次/min，張力為(1.27±0.02)g。

圖1 大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮曲線

2.2 不同濃度的IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 不同濃度的IL－1β孵育60 min，大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均被抑制，見表1。

表1 IL－1β組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表1 IL－1β組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.05;②與本組給藥前比較，P＜0.01。

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2.3 亞甲基藍(lán)作用下IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 與IL－1β組相比，亞甲基藍(lán)組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均不同程度的增加，見表2。

2.4 L－NAME作用下IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的作用 與IL－1β組相比，L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的振幅、頻率和張力均不同程度的增加，即IL－1β對(duì)大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮的抑制作用被LNAME部分抵消，見表3。

表2 亞甲基藍(lán)組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表2 亞甲基藍(lán)組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.01。

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3 討 論

幽門括約肌的主要作用在于控制食物在胃內(nèi)消化停留的時(shí)間以及排往十二指腸的速度，從而防止胃排空過快，并抗十二指腸胃反流。這一作用主要依賴幽門括約肌的持續(xù)張力產(chǎn)生的靜息壓和周期性收縮產(chǎn)生的收縮壓來實(shí)現(xiàn)和維持。幽門括約肌異常會(huì)引起多種疾病，如先天性肥厚性幽門狹窄會(huì)引起小兒嘔吐而不能進(jìn)食，進(jìn)而產(chǎn)生全身性營(yíng)養(yǎng)不良、脫水及酸中毒等［3］。幽門管潰瘍［4］、幽門梗阻［3］等疾病的發(fā)生也與幽門括約肌的收縮與舒張緊密關(guān)聯(lián)。

幽門括約肌的運(yùn)動(dòng)受多種因素的調(diào)控，包括神經(jīng)因素，體液因素和局部激素等。其中主要因素是神經(jīng)因素和體液因素，然而無論是神經(jīng)因素還是體液因素引起的幽門括約肌收縮，最終都要依賴細(xì)胞內(nèi)的Ca2+的介導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)由細(xì)胞膜鈣通道、鈣泵、細(xì)胞器的鈣攝取和釋放以及Na+－Ca2+交換體的參與。有文獻(xiàn)報(bào)道，影響平滑肌張力的因素有:二酰甘油/蛋白激酶C信號(hào)系統(tǒng)、IP3/Ca2+信號(hào)系統(tǒng)、細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP的含量以及鉀離子通道的開放狀態(tài)［5］。

IL－1家族是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物質(zhì)，包括IL－1、IL－1受體和IL－1受體拮抗劑(IL－A ra)等，主要由成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥遞質(zhì)，對(duì)免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)等具有極其廣泛的生物學(xué)作用。文獻(xiàn)報(bào)道，IL－1主要以兩種形式存在:IL－1α和IL－1β，二者雖然具有不同的氨基酸序列，但其三維空間結(jié)構(gòu)相似，都能夠與同一細(xì)胞表面的受體結(jié)合，且與靶細(xì)胞上的IL－1受體的親和力相同［6］。IL－1α和IL－1β分別與其受體結(jié)合，通過G蛋白耦聯(lián)機(jī)制發(fā)揮作用IL－1β通過促進(jìn)前列腺素的合成及其分泌而發(fā)揮作用:也可以依賴花生四烯酸，或誘導(dǎo)合成其他花生四烯酸物質(zhì)(如PGE2)，進(jìn)而引起發(fā)熱，IL－1β還可以與其他細(xì)胞因子(如IFN/TNF)聯(lián)合，誘導(dǎo)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量誘生型一氧化氮合酶，進(jìn)而增加NO 的產(chǎn)生［7－8］。

目前研究幽門括約肌自發(fā)收縮活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)方法有在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)。離體實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較在體實(shí)驗(yàn)容易控制，而且重現(xiàn)性較好，是分析性研究較常用的一種手段，是研究藥物作用機(jī)制的有效方法。

本研究采用離體組織灌流的方法，結(jié)果表明，IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，表現(xiàn)為收縮的振幅、頻率和張力均下降。平滑肌的收縮活動(dòng)改變的最終原因歸結(jié)為細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，說明IL－1β能夠降低幽門括約肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。

表3 L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

表3 L－NAME組大鼠離體幽門括約肌自發(fā)收縮振幅、頻率和張力變化(±s)

注:①與本組給藥前比較，P＜0.01。

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為了確定IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮是否與NO有關(guān)，本研究選取了L－NAME進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。L－NAME能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制一氧化氮合成酶(NOS)，從而降低NOS的生物學(xué)效能，是一種非選擇性的一氧化氮合成酶抑制劑。NOS主要以L－精氨酸為底物催化內(nèi)源性NO的合成。脂溶性小分子NO是一種氣態(tài)的第二信使，在體內(nèi)多種細(xì)胞中均有產(chǎn)生，且具有顯著的生物活性，如促進(jìn)遞質(zhì)釋放、舒張平滑肌、參與突觸可逆性過程等。研究表明，NO能夠直接通過平滑肌細(xì)胞膜與GC上的鐵離子結(jié)合，進(jìn)而催化cGMP的生成［9］，最終導(dǎo)致平滑肌舒張。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L－NAME能部分抵消IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，說明IL－1β的作用機(jī)制與NO有關(guān)。為了進(jìn)一步確定IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮是否與細(xì)胞內(nèi)的cGMP有關(guān)，本研究選擇了亞甲基藍(lán)進(jìn)行阻斷。亞甲基藍(lán)是胞漿可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的一種抑制劑，而胞漿可溶性鳥苷酸環(huán)化酶是催化cGMP生成的重要活性酶。GTP在鳥苷酸環(huán)化酶(GC)的作用下發(fā)生環(huán)化，進(jìn)而生成cGMP，cGMP與平滑肌上的依賴cGMP的蛋白激酶G(PKG)結(jié)合并使之激活，通過對(duì)底物蛋白的磷酸化發(fā)揮生理功能，如活化的PKG能引起鈣通道的磷酸化，也可以引起ADPR環(huán)化酶的磷酸化增強(qiáng)其活性進(jìn)而催化生成RyR的生理性配體——cADPR，這些作用都能降低細(xì)胞中鈣離子濃度，導(dǎo)致平滑肌舒張［10］。本研究結(jié)果顯示，亞甲基藍(lán)能部分抵消IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮的作用，這進(jìn)一步表明，IL－1β抑制幽門括約肌自發(fā)收縮與細(xì)胞內(nèi)cGMP的含量有關(guān)。

綜上所述，IL－1β能夠抑制大鼠離體幽門括約肌的自發(fā)收縮，其作用機(jī)制可能與cGMP、NO有關(guān)。

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