次黃嘌呤灌胃加冰敷法誘導大鼠急性痛風性關節炎模型

孫賽君，袁卉，蔣金鵬，陶露，錢鋒

（長江大學醫學院，湖北荊州434023）

痛風性關節炎是因嘌呤代謝紊亂導致高尿酸血癥、尿酸鹽在關節周圍沉積而引起的炎癥反應，臨床表現主要為紅腫熱痛［1－2］。目前國內外針對痛風性關節炎治療藥物的研究以降低血尿酸水平、消炎、消腫和鎮痛為主［3－5］。而研究所用動物模型仍以Coderre在1987年建立的關節腔注射微晶尿酸鈉（MSU）大鼠痛風性關節炎模型為主［6］。但是該模型并未涉及痛風性關節炎的發病基礎——高尿酸血癥，在評價抗痛風藥物的作用機制上有明顯缺陷。相對而言，高尿酸血癥的動物模型比較容易建立。目前有高嘌呤膳食、尿酸酶抑制劑和破壞尿酸酶表達基因等方法［7－9］。然而因多數哺乳動物體內都存在人體內沒有的尿酸酶，所以將高尿酸血癥模型轉化為痛風模型極為困難［10］。國內出現了聯合使用Coderre法和尿酸酶抑制劑或次黃嘌呤建立高尿酸痛風大鼠模型的嘗試［10］，但該方法只是分別誘發急性痛風性關節炎和高尿酸血癥，因此未被廣泛采用?，F存急性痛風性關節炎模型都有很多不完善之處，給痛風性關節炎的研究帶來了極大的不便，因此建立高尿酸血癥誘發的痛風性關節炎動物模型迫在眉睫。

從人類痛風性關節炎的發病情況來看，高尿酸血癥是其發病基礎，而寒冷的外部環境是其重要誘發因素之一。本實驗將以次黃嘌呤灌胃這種簡單的方法誘導大鼠短時間內出現高嘌呤血癥，同時對大鼠右下肢膝關節部位進行冰敷，觀察是否可誘發急性痛風性關節炎。如果誘發成功，則為該疾病的基礎和臨床研究建立了更為適用的動物模型。另外，因次黃嘌呤灌胃和冰敷對大鼠創傷較小，可重復多次進行，所以本實驗還將嘗試通過重復誘導同一關節的痛風來觀察是否可以建立慢性痛風性關節炎模型。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，體質量（200±20）g，由武漢大學動物實驗中心提供，實驗動物飼養許可證號：SCXK（鄂）2008－0004。次黃嘌呤（Sig ma產品）。

1.2 方法

1.2.1 次黃嘌呤溶液配置 次黃嘌呤5g溶于100 ml蒸餾水中，配成5%溶液，灌胃劑量按10 ml／kg體質量來計算。

1.2.2 動物分組 健康雄性SD大鼠25只，適應性喂養1周后，隨機分4組進行實驗：正常組7只；冰敷組6只；次黃嘌呤灌胃組6只；次黃嘌呤灌胃加冰敷組6只。

1.2.3 冰敷方法 小氣球灌水冷凍1～2h，形成冰水混合物。將需要冰敷的SD大鼠以仰臥位包裹固定于木板上，保持右下肢伸直微曲。將含冰水混合物的小氣球用紗布包裹放置于右下肢膝關節正上方，接觸面覆蓋膝關節正面和左右兩側。每半小時更換一次，保持低溫。每天持續冰敷3h。次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在灌胃完成半小時后開始冰敷，其它同冰敷組。

1.2.4 結果判定 ①關節腫脹程度：冰敷完成1h后，關節屈位，測量橫向最大徑。每只大鼠取右下肢最大徑減左下肢最大徑差值，組內求平均值，然后進行組間統計學分析。②步態評分標準：冰敷完成2h后，觀察大鼠步態，正常行走記0分；輕微跛行，即右下肢略有彎曲，記1分；跛行，即右下肢可觸及地面但明顯彎曲，記2分；重度跛行，即右下肢不觸及地面，僅三足行走，記3分。組內求平均值，然后進行組間統計學分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠右側膝關節腫脹程度比較

實驗過程持續10d，次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠從第3天開始出現顯著的關節腫脹及其它身體不適反應，第7天開始出現食欲不振和腹瀉，實驗第10天出現死亡，6只大鼠中死亡2只，于是決定停止實驗。與正常組大鼠比較，冰敷組和次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右側膝關節腫脹都有統計學差異（P＜0.01），尤以第3～7天次黃嘌呤灌胃加冰敷組的改變最為明顯。第2～7天，次黃嘌呤灌胃加冰敷組對比冰敷組也有統計學差異（P＜0.01）。圖1中顯示了第1～10天各組大鼠左右膝關節橫向最大徑差值的組內平均值和標準差。

圖1 不同時相各組大鼠左右膝關節橫向最大徑差值比較

2.2 各組大鼠步態評分比較

正常組、次黃嘌呤灌胃組和冰敷組大鼠在實驗期間步態均無異常，僅次黃嘌呤加冰敷組大鼠在實驗第3～6天出現輕度跛行，第1～6天步態評分分別為：0、（0.5±0.55）、（1.5±0.55）、（1.8±0.4）、（1.8±0.4）、（1.7±0.52）分。第7天開始，該組大鼠在冰敷后出現明顯身體不良反應，如食欲不振、腹瀉、毛發豎立、活動減少等。冰敷后數小時內，該組大鼠多俯臥不動，刺激無效，故難以判斷步態，而且從偶爾站立情況來看，左右下肢并無顯著差異。因此，從第7～10天，次黃嘌呤加冰敷組大鼠步態評分都記為零。

2.3 大鼠關節形態學檢查

為了觀測重復次黃嘌呤灌胃加冰敷對大鼠膝關節是否可造成長期影響，在停止灌胃和冰敷3d后，再次檢測該組大鼠右下肢膝關節腫脹程度和步態，并以戊巴比妥鈉麻醉后暴露右下肢膝關節進行形態學檢測。結果發現關節腫脹消失，步態正常，鏡下形態學特征與正常關節無差異。

3 討論

人類易發痛風是因長期高嘌呤飲食和體內缺乏尿酸酶等因素導致的嘌呤代謝紊亂、高尿酸血癥，最終尿酸鹽因飽和在組織內沉積而引起［1］。哺乳類實驗動物體內都含有尿酸酶，可迅速將體內過多的尿酸代謝為水溶性良好并無毒的尿囊素隨尿液排出體外，因此通過高尿酸血癥誘發痛風動物模型極為困難［11］?？紤]到低溫環境對痛風性關節炎的誘發作用，而國內亦有通過單純低溫處理小鼠膝關節制備骨性關節炎動物模型的先例［12］，筆者設計以次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型為基礎，并在灌胃后立即對大鼠右下肢膝關節持續冰敷3h以促發尿酸鹽在低溫局部析出結晶，從而建立急性痛風性關節炎大鼠模型。次黃嘌呤灌胃法建立的高尿酸血癥大鼠模型可致血尿酸水平短時間內達到500μmol／L左右［9］，而尿酸鹽在30oC時的最大溶解度不足300μmol／L［13］，若不考慮大鼠關節腔內組織液與血液間尿酸鹽濃度的差異，則以局部冰敷促使膝關節內發生尿酸鹽結晶在理論上是可行的。

實驗結果表明單純次黃嘌呤灌胃組大鼠對比正常對照組未出現腫脹和步態異常。而冰敷組大鼠膝關節在每次冰敷后都有一定程度腫脹，雖然與正常對照組有統計學差異，但腫脹程度并不明顯，可能與低溫導致的關節水腫和炎癥反應有關［12］。冰敷組大鼠并未表現顯著的步態異常。雖然文獻有通過持續低溫刺激膝關節30d建立骨性關節炎小鼠模型的報道，但在本實驗的實際操作中卻發現諸多不便。其一，未經過麻醉將動物固定并暴露單側膝關節進行長時間冰敷實際對動物是一種制動，對后期行為學評價有影響；其二，操作有困難，大鼠膝關節部位較小，冰敷范圍難以控制；其三，冰敷組大鼠在重復多天冰敷后出現明顯身體不適，如活動力下降、腹瀉和食欲減退等，說明該操作不可長期持續，否則會嚴重影響對結果的評價。本實驗中，冰敷組大鼠持續冰敷10d，對比次黃嘌呤灌胃加冰敷組，未出現死亡和嚴重不良反應，但都有輕微不適，在停止實驗3d后都恢復正常。

次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠右下肢膝關節的腫脹程度，與其它實驗組之間都存在統計學差異（P＜0.01），尤以第3～6天最為顯著（見圖1）。而步態評分亦顯示該組大鼠在第3～6天的活動障礙最為明顯，至少表現為輕度跛行，多數大鼠表現為中度跛行。在實驗過程中，從第1～10天，關節腫脹程度隨著實驗進程有明顯波動，出現一定的時間依賴性，這可能與高尿酸血癥建模中尿酸在實驗動物體內累積的濃度有關［10］。在一定范圍內，痛風性關節炎的嚴重程度應與血尿酸濃度呈正相關。當血尿酸濃度達到或超過尿酸的飽和度后即可析出并誘發急性痛風性關節炎，且嚴重程度會隨濃度的增加而加重。如圖1所示，血尿酸濃度應在第五天達高峰值，而后會隨著尿酸酶的代償性增多和活化而逐漸下降，最終與冰敷組相似。因此，在后期建模中加入尿酸酶抑制劑（如氧嗪酸）可能會有更好的效果9。

由于次黃嘌呤灌胃加冰敷組大鼠在第10天出現2例死亡（2／6），所以被迫停止實驗。停止實驗3d后該組其它大鼠各項觀測數據比較正常組均無統計學差異（P＞0.05），鏡下檢查大鼠關節軟骨組織形態亦無差異，說明實驗組大鼠已完全恢復，未能誘發慢性痛風性關節炎。這可能是因為大鼠本身具備尿酸酶，可以很好的矯正高尿酸血癥和清除沉積的尿酸結晶。初步認為，如果無法建立穩定的高尿酸血癥動物模型就難以建立以此為基礎的慢性痛風性關節炎動物模型。

綜上所述，重復次黃嘌呤灌胃和低溫處理大鼠膝關節可誘發大鼠急性痛風性關節炎模型，與其它現有動物模型相比更符合人類痛風的發病機制。該模型完全模擬人類由高嘌呤膳食和低溫環境誘發的痛風性關節炎發病機制，且避免了關節腔注射等外界干擾因素，更適用于目前對急性痛風性關節炎的相關基礎和臨床研究，也可成為建立完美的痛風性關節炎動物模型的基礎。

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