水楊酸對人肝癌HepG2細胞體外生長的影響的研究*

林 冰，郎錦義，雷 晴

(1．成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，成都 610072;2．四川省腫瘤醫(yī)院，成都 610041)

水楊酸(salicylic acid，SA)是從植物白柳回(white willow back)和冬青葉(wintergreen leaves)中所獲得的物質。作為一種重要的植物激素，SA具有十分重要的藥理作用［1］。乙酰水楊酸(Acetylsalicylic acid，ASA)的抗炎作用是由SA產生的，目前已廣泛應用于臨床。有研究表明，在服用阿司匹林的人群中，SA可以減少1/4患結直腸癌的風險和1/3因該病致死的風險，幾十年后死于包括胃癌、食道癌及肺癌在內的實體腫瘤的可能性要降低21%［2］。作為一種抗炎藥物，SA和ASA具有抗腫瘤的特性。不斷增加的證據顯示［3-8］，SA具有誘導或促進多種腫瘤細胞凋亡的作用，包括結直腸癌、嗜鉻細胞瘤，乳腺癌，黑色素瘤和白血病等。最近有報道［9，10］，除SA衍生物法尼基硫代水楊酸(Farnesylthiosalicylic acid)可誘導膠質母細胞瘤和肝癌細胞的凋亡和生長抑制外，但SA直接作用于人肝癌細胞誘導其凋亡和生長抑制作用尚未見報道。因此，本文對SA是否抑制人肝癌HepG2細胞的生長和潛在機制進行了初步研究和探討。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑

水楊酸 (Salicylic Acid，含量99．5%HPLC)，購自成都麥德森生物科技公司;MTT、二甲基亞砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)，購自美國Sigma公司;EdU試劑盒購自廣州銳博生物科技公司。

1．2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2(美國ADCC)常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基(全培基)中，于37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)，取指數(shù)生長期細胞進行以下實驗。

1．3 MTT法測定細胞存活

將呈指數(shù)生長的HepG2細胞用0．25%胰酶消化液消化，并用10%FCS RPMI-1640培養(yǎng)基制成5×105細胞/ml的單細胞懸液，從中取100μl接種于96孔培養(yǎng)板中;將熱溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的SA濃縮液，用全培基分別稀釋成終濃度的2×液，分別取100μl加入上述96孔培養(yǎng)板中，至終濃度分別為 2．5mmol/L、5．0 mmol/L、7．5 mmol/L 和10 mmol/L;對照孔和空白孔加入100μl全培基，每個濃度組設6個復孔，置于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48hrH后，除空白孔外，所有孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃反應 4hr后，棄上清，加入 150μl DMSO，振蕩溶解后，用酶標儀(Bio-Rad)于570nm波長測定吸光度A值，并下式計算細胞存活率，擬合藥物濃度-細胞存活率曲線，用獲得的函數(shù)式計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

1．4 EdU檢測細胞增殖活性

按EdU試劑盒說明書敘述的實驗程序進行。取指數(shù)生長期HepG2細胞，以每孔1×105細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段，用7．5mmol/L SA處理24hr。用全培基按1000∶1的比例稀釋EdU溶液，制備成50μmol/L的EdU反應液;每孔加入100μl孵育2小時，棄培養(yǎng)基;每孔加入4%多聚甲醛-PBS 50μl，室溫固定30分鐘;每孔加入1 × A-pollo?染色反應液100μl，避光室溫脫色30分鐘后，棄染色反應液;用1×Hoechst33342進行DNA染色，于倒置熒光顯微鏡(Olympus)下觀察并采圖。

1．5 FCM檢測細胞周期和凋亡

［4］的方法。收集指數(shù)生長期HepG2細胞，消化制成單細胞懸液，取5×105細胞接種于6孔板中，24hr后加入SA溶液至終濃度為7．5mmol/L，2×105細胞接種于對照孔，培養(yǎng) 48hr后，消化收集細胞，PBS離心洗滌1次，冰預冷的70%乙醇固定1hr，離心，棄乙醇，用PBS離心洗滌1次，棄上清;加入反應Buffer制成單細胞懸液，再加入PI，避光反應30分鐘后，上流式細胞儀(FCM，Becton Dickinson)進行檢測和分析。

1．6 統(tǒng)計分析

應用SPSS13．0軟件進行數(shù)據分析，采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 SA對HepG2細胞存活的影響

MTT法測定結果顯示，不同濃度SA作用于HepG2細胞48hr，其存活率呈濃度依賴的降低，分別為 69．2% ± 3．2%、59．2% ± 2．96%、50．8% ±2．50%、45．8% ±2．29%，其 IC50值為 8．92 mmol/L±0．45 mmol/L(見圖1)，表明SA對HepG2細胞具有明顯的生長抑制作用。

圖1 SA對HepG2細胞存活率的影響

2．2 SA對HepG2細胞增殖活性的影響

SA降低了DNA合成時EdU的摻入，導致SA處理的HepG2細胞的紅色熒光強度及其細胞數(shù)(圖2-A)顯著小于對照細胞(圖2-B)，表明SA通過抑制HepG2細胞的DNA合成和復制，降低HepG2細胞的增殖活性。

2．3 SA對HepG2細胞周期和凋亡的影響

FCM結果顯示，SA持續(xù)作用24hr后，HepG2細胞周期G0/G1比例較對照細胞增加了31．2%，表明SA能夠顯著誘導HepG2細胞周期G0/G1阻滯(表1);同時，SA作用于HepG2細胞后，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，與對照組細胞凋亡率2．3% ±0．11%比較，其凋亡率24．9% ±0．32%顯著增加(圖3)，P＜0．05，表明SA可誘導HepG2細胞凋亡。

圖2 SA顯著抑制HepG2細胞的增殖活性(×200);藍色熒光代表細胞核，紅色熒光代表增殖活性較強的細胞。

表1 SA對HepG2細胞周期的影響

圖3 SA誘導HepG2細胞凋亡

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都位居世界前列，且呈逐年上升趨勢。由于肝癌的發(fā)生機制仍未明確，惡性程度極高，導致臨床治療的預后極差和生存期短。HBV感染引起肝組織的慢性炎癥作用導致肝細胞的正常基因表達如癌基因和抑癌基因突變，以及干擾了細胞信號轉導，促進其惡性轉化和腫瘤發(fā)生。靶向肝癌發(fā)生相關基因表達及其信號轉導通路，阻斷或抑制介導肝癌細胞增殖和抗凋亡的靶標分子是當前誘導或促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長的主要藥物干預策略。

植物激素(phytohormone)是植物體內存在的一類天然的生理活性物質，調節(jié)控制著植物生活周期的各個方面，包括植物腫瘤。植物腫瘤的生物學特征在很多方面與哺乳動物腫瘤具有相似性。SA是一種小分子酚類植物激素，在包括植物免疫響應的多種生理過程中發(fā)揮一個重要的調節(jié)作用。作為植物免疫調變劑，SA介導的防御信號網絡研究取得了顯著進展［11］。

最近Hawley在《SCIENCE》報道了對SA研究的重大發(fā)現(xiàn)［12］，SA是阿司匹林的一種天然成分，可直接激活與腫瘤抑制相關的一條信號通路，即直接作用并活化5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路。AMPK 是細胞過程的一個關鍵調控因子，在細胞代謝中起著關鍵作用，其參與了細胞增殖，細胞凋亡和細胞周期及其生長的調節(jié)作用，是一種抗生長分子，尤其在肝臟中發(fā)揮著更大的作用［13］。研究證實［14］，AMPK活化通過上調p53p21軸介導的上調細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)引起 G1細胞周期阻滯和通過抑制mTOR信號通路介導的細胞生長和增殖必需的蛋白質合成，從而抑制細胞的增殖。假設AMPK活化丟失促進腫瘤的發(fā)展，相反，藥理激活AMPK最近已被證明對許多人類腫瘤細胞株，人類腫瘤異種移植和小鼠肝癌移植瘤具有細胞毒作用［15］。我們的結果顯示，SA可阻止HepG2細胞由G1期向S期移行，導致G1期阻滯，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，提示這可能與SA活化AMPK介導的細胞增殖的負性調節(jié)作用有關。

綜上所述，SA在體外能夠抑制肝癌細胞的生長。AMPK作為一個靶標分子，SA(一種我們接觸了幾千年的天然化合物)可直接激活AMPK，有可能為肝癌的潛在治療作用提供新的途徑。

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