葛根素對大鼠顱腦損傷后ICAM－1和NF－κB表達的影響

馮納婷，馮雅碧

創傷性腦損傷 （traumatic brain injury，TBI）是神經外科最常見的疾病之一，局部組織的炎癥反應是繼發性腦損傷的重要因素［1］。研究表明，血管內皮表面的細胞間黏附分子 （ICAM－1）可以引起顱腦損傷后腦組織病理生理改變，大量中性粒細胞聚集和黏附于腦血管內皮并浸潤到損傷腦組織中［2，3］；核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB） 調控 B淋巴細胞免疫球蛋白κ輕鏈的基因轉錄，與機體的炎癥過程密切相關［3，4］。葛根素是一種天然多酚類化合物，結構類似雌二醇，具有某些雌激素樣作用。研究發現它是一種天然的抗氧化劑，可以清除各種氧自由基和抑制脂質過氧化，保護細胞膜的結構，從而具有抗氧化、降血壓、抗癌等多種藥理活性，目前研究表明它對大鼠創傷性腦損傷具有一定的保護作用［5］。本試驗即通過建立大鼠顱腦損傷模型，給予葛根素治療后，運用分子生物學手段，分析腦組織中ICAM－1和NF－κB表達的變化，初步探討葛根素保護顱腦損傷后的分子機制，為葛根素的進一步研究和應用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 丙二醛 （MDA） 和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。葛根素購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%。ICAM－1和 NF－κB 抗體購自 sigma公司；dNTP和TagDNA聚合酶購自Promega公司。成年健康SD大鼠15只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 建立大鼠顱腦損傷動物模型［6］，隨機分為假手術組、模型組和治療組，每組各5只。腹腔注射4%戊巴比妥鈉，沿中線左側切開頭皮，分離骨膜，保持完整硬膜，從高處撞擊硬膜，造成顱腦損傷。假手術組僅打開顱骨，不致腦損傷。模型組大鼠，給予生理鹽水處理；治療組大鼠，建立模型前預先口服灌胃50 μmol/L的葛根素7 d。

1.2.2 測定MDA含量和SOD活性 按試劑盒操作說明，通過TBA硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測SOD活性。

1.2.3 RT－PCR 實驗 收集各組大鼠腦組織，TRIZOL法提取細胞總mRNA。按照基因BANK序列設計合成引物（大連寶生物公司合成）。ICAM－1上游引物序列，5＇－GGTGGGCAAGAACCTCATCCT－3＇；下游引物序列，5＇－CTGGCGGCT CAGTGTCTCATT－3＇。NF－κB基因序列設計引物，由大連寶生物公司合成：5＇－TCAATGGCTACACAGGACCA －3＇；5＇－CACTGTCAC CTGGAACCAGA－3＇。β－actin 序列：5＇－ATCATGTT TGAGACCTTCAACA－3＇； 反義 5＇－CAT CTCTTGCT CGAAGTCCA－3＇。 RT－PCR 分析 ICAM－1 和 NF－κB mRNA 表達的變化：5 μl PCR 產物，加1 μl的loading buffer混勻，加入樣品孔內，電壓為5 V/cm，電泳 30 min，終止電泳。 0.5%溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像儀觀察圖像并計算灰度值。

1.2.4 Western blot實驗 收集各組大鼠腦組織，加入1 ml胞裂解緩沖液，機械勻漿，12000 r/min，離心30 min，收集上清。取各組蛋白樣品進行SDSPAGE凝膠電泳，轉膜，5%的脫脂乳封閉非特異性染色，加 ICAM－1 和 NF－κB 一抗（1∶1000），孵育后加過氧化物酶標記的二抗，顯色，觀察結果。

2 結 果

2.1 各組SOD活性及MDA含量 表1結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠，SOD活性顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加（P＜0.05），提示模型組動物顱腦損傷明顯；經葛根素處理的治療組大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

表1 各組SOD活性及MDA含量（±s）

注：與假手組相比，＊P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05

SOD（NU /mg） MDA（μmol/g）61.46±2.39 2.31±0.21 33.18±1.42＊ 4.64±0.11＊51.36±1.31＃ 2.93±0.3＃分組 n假手術組 5模型組 5治療組 5

2.2 葛根素對ICAM－1和NF－κB表達的影響RT－PCR結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA表達顯著升高（P＜0.05，n＝5），經葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中 ICAM－1和 NF－κB mRNA 表達顯著降低（P＜0.05，n＝5），結果見圖 1。

圖1 RT－PCR檢測ICAM－1和NF－κB的表達

Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著升高（P＜0.05，n＝5），經葛根素處理的治療組大鼠，與模型組大鼠相比較，腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著降低（P＜0.05，n＝5），結果見圖 2。

圖2 Western blot檢測ICAM－1和NF－κB的表達

3 討 論

葛根素是一種多酚類化合物，屬植物雌激素類，具有很強的抗氧化活性。葛根素在4位和7位各有1個羥基，可與雌激素受體（ER）相結合，具有抗自由基損傷、擴張心血管、降低心肌耗氧、改善心肌代謝、抑制血小板活化與聚集等作用［7］。細胞間黏附因子－1（ICAM－1）廣泛分布于中樞神經系統中，分為跨膜和可溶性蛋白兩種形式，可介導多種炎癥細胞黏附于血管內皮細胞，是多種炎性因子發揮作用的分子基礎［8，9］。 轉錄因子 NF－κB 主要存在于細胞質中，炎癥介質、氧化應激等刺激可激活NF－κB信號轉導通路，暴露NF－κB的DNA結合位點，發生核轉位，與細胞因子、黏附分子等的啟動子或增強子的特異性位點結合，啟動基因轉錄的過程［10，11］。創傷性腦損傷后，局部組織易發生炎癥反應，引起繼發性腦損傷。如何降低或減弱炎癥反應，避免繼發性腦損傷的發生，保護受損的腦組織，降低高致殘率、病死率，是目前臨床研究中亟待解決的問題。

本研究中，通過建立大鼠顱腦損傷動物模型，經葛根素預處理后，分別觀察各組大鼠腦組織中SOD活性及MDA含量的變化，結果提示，與假手術組比較，模型組大鼠SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（P＜0.05），而經葛根素處理的大鼠，可以顯著增加腦組織中SOD的活性，并降低MDA的含量。RT－PCR和Western blot實驗分別觀察葛根素對ICAM－1和NF－κB mRNA及蛋白表達的影響，結果均顯示，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中ICAM－1和NF－κB蛋白表達顯著升高，經葛根素處理后，大鼠腦組織中NF－κB蛋白表達顯著降低。以上結果均提示，大鼠顱腦受到損傷后，局部組織炎癥反應顯著，炎癥相關指標均發生明顯的變化，而經葛根素預處理的大鼠，可以抑制或降低顱腦受到損傷后腦組織中局部炎癥反應，調控或影響ICAM－1和NF－κB分子的信號通路，起到腦保護的效應。

本實驗以多酚類化合物葛根素為研究對象，通過建立大鼠顱腦損傷動物模型，利用RT－PCR和Western blot等手段，分析和檢測大鼠腦組織中血管內皮表面的細胞間黏附分子－1（ICAM－1）和NF－κB的變化，初步探討葛根素影響顱腦損傷后相關因子表達的作用機制，為葛根素的進一步研究和應用提供理論基礎和實驗依據。

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