IQ-G-OBzl對人食管癌細胞體內外抑制作用的研究

楊國棟，張曉英，馮志松，任 權，江毅敏

(1川北醫學院附屬醫院，四川南充637000;2川北醫學院基礎醫學院)

據統計，全世界每年約有30萬人死于食管癌［1～4］;我國每年約15萬人死于食管癌，居世界首位［4，5］。食管癌的治療以手術、放療等創傷較大的治療方式為主，目前尚無有效的治療藥物［6，7］。N-異喹啉-3-羧酸-L-甘氨酸芐酯(IQ-G-OBzl)是將L-甘氨酸芐酯引入3-羧酸氧化異喹啉的3羧基端所得到的一種含氧化喹啉結構的新化合物［8］;Zheng等［8］研究表明其可抑制宮頸癌細胞Hela及人早幼粒白血病細胞HL-60生長。研究表明氧化喹啉可通過DNA扦插，損傷腫瘤細胞DNA達到抑制腫瘤細胞的作用［9～13］，但具體機制尚不清楚。研究發現，活性氧(ROS)在細胞DNA損傷中占有重要地位，氧化喹啉類化合物可能通過提高細胞內活性氧(ROS)水平損傷腫瘤細胞 DNA［14～16］，但需進一步驗證。2013年1～10月，我們觀察了IQ-G-OBzl體內、外對人食管癌細胞生長的抑制作用及其對腫瘤細胞內ROS水平的影響，初步探討IQ-G-OBzl抗食管癌的作用機制，旨在為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞Eca-109及EC-9706購于中國科學院上海細胞所。N-異喹啉-3-羧酸-L-甘氨酸芐酯按Zheng等［8］的方法合成，高壓滅菌后4℃保存備用;氟脲嘧啶注射液(5-FU)由上海旭東海普藥業有限公司生產，產品批號:040805。SPF級Balb/C裸小鼠(5周齡，雌性，體質量18～20 g)購自中國醫學科學院腫瘤研究所。

1.2 體外實驗

1.2.1 IQ-G-OBzl對食管癌細胞生長的影響的觀察取指數生長期Eca-109及EC-9706細胞分別接種于96孔板并分為四組。5-FU組、L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組及IQ-G-OBzl組分別給予100、1 000及10 000 nM的相應藥物干預。作用20 h后加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，37℃孵育4 h后棄去上清，加DMSO 100 μL，微量振蕩儀振蕩10 min至結晶完全溶解，掃描分光酶標儀讀取A490，細胞生長抑制率=［(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%］。計算IC50值。

1.2.2 IQ-G-OBzl對食管癌細胞ROS水平的影響的觀察 將Eca-109及EC-9706細胞分為L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組、IQ-G-OBzl組及生理鹽水組，除生理鹽水組外，其余各組用400 nM的相應藥物干預。干預后予120 μmol/L的雙氫羅丹明123(Rh123)，37℃ 孵育24 h后收集 Eca-109及 EC-9706細胞，以PBS漂洗一次后上機檢測Rh 123熒光強度即代表Eca-109、EC-9706細胞的ROS水平。

1.3 體內實驗

1.3.1 食管癌裸鼠模型制作及干預 115只裸鼠飼養于SPF屏障系統中(飼料、水及其用具均經滅菌處理)。對數生長期人食管癌Eca-109細胞株，PBS清洗后制成1×1010/mL細胞懸液，0.1 mL接種于裸鼠皮下。將115只荷瘤鼠分為五組。生理鹽水組(15只)予生理鹽水0.2 mL灌胃，L-甘氨酸芐酯組(30只)、3-羧酸異喹啉組(30只)及IQ-G-OBzl組(30 只)分別予1、10、100 μmol/kg 的相應藥物灌胃(每劑量10只)，5-FU 組(10只)予100 μmol/kg的5-FU灌胃;均每日1次。

1.3.2 觀察項目 ①大鼠存活率:統計實驗過程中大鼠自然死亡率(非處死)。②腫瘤生長抑制率(抑瘤率):于灌胃第28天處死動物，剝離腫瘤并稱重。抑瘤率=(對照組腫瘤重量-實驗組腫瘤重量)/對照組腫瘤重量×100%;③外用血白細胞數量:處死大鼠時摘除眼球取血計數白細胞。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件行統計學處理。采用單因素方差分析，所有數據均用±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外實驗結果

2.1.1 IQ-G-OBzl對食管癌細胞生長的影響 各組IC50比較見表1。由表1可見，IQ-G-OBzl組Eca-109及EC-9706的IC50值均低于L-甘氨酸芐酯組及3-羧酸異喹啉組，但高于5-FU組(P＜0.05);IQ-G-OBzl組Eca-109細胞的 IC50低于EC-9706細胞(P＜0.05)。

表1 各組干預藥物對細胞的IC50比較(n=6，±s)

表1 各組干預藥物對細胞的IC50比較(n=6，±s)

注:與L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組及5-FU組比較，△P＜0.05;與 EC-9706 細胞比較，*P ＜0.05

IC50組別384.74 ±25.00 435.58 ± 39.38 Eca-109細胞 EC-9706 1 052.80 ± 76.58 3-羧酸異喹啉組 1 538.94 ±94.68* 1 738.78 ±101.23 IQ-G-OBzl組 498.42 ±51.33△＊ 529.85 ± 32.86△5-FU組細胞L-甘氨酸芐酯組 973.78 ±78.80*

2.1.2 IQ-G-OBzl對食管癌細胞ROS水平的影響除3-羧酸異喹啉組外，L-甘氨酸芐酯組、IQ-G-OB-zl組細胞內 ROS水平均高于生理鹽水組(P＜0.05);L-甘氨酸芐酯組及3-羧酸異喹啉組均低于IQ-G-OBzl組(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組細胞內ROS水平比較(n=6，±s)

表2 各組細胞內ROS水平比較(n=6，±s)

注:與生理鹽水組比較，△P＜0.05;與 IQ-G-OBzl組比較，*P＜0.05

組別ROS(mFl)EC-9706 L-甘氨酸芐酯組 62.68±5.37△＊ 59.85±8.87 Eca-109△＊19.89 ±2.35 21.22 ±3.07 3-羧酸異喹啉組 15.21 ±3.01* 19.02 ±4.44*IQ-G-OBzl組 88.07 ±9.99△ 76.67 ±7.37△生理鹽水組

2.2 體內實驗結果

2.2.1 大鼠存活率 5-FU組存活6只，存活率為60%，生理鹽水組存活10只，存活率為66%，L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組、IQ-G-OBzl組均存活，存活率為100%。

2.2.2 瘤重及抑瘤率 各組瘤重及抑瘤率見表3。由 表3可見，IQ-G-OBzl組、L-甘氨酸芐酯組及3-羧酸異喹組瘤重均低于生理鹽水組、但均高于5-FU組;抑瘤率均低于5-FU組(P均＜0.05);隨用藥劑量升高瘤重降低、抑瘤率升高;IQ-G-OBzl組瘤重低于、抑瘤率高于L-甘氨酸芐酯組及3-羧酸異喹組(P均 ＜0.05)。

表3 各組瘤重及抑瘤率比較(±s)

表3 各組瘤重及抑瘤率比較(±s)

注:與生理鹽水組及5-FU組比較，*P＜0.05;與L-甘氨酸芐酯組及3-羧酸異喹啉組同劑量比較，#P＜0.05

組別 n 瘤重(g) 抑瘤率(%)10 1.91 ±0.12 L-甘氨酸芐酯組1 μmol/kg 10 1.79 ±0.14* 6.09 ±0.61*10 μmol/kg 10 1.70 ±0.10* 10.55 ±0.96*100 μmol/kg 10 1.65 ±0.24* 13.39 ±1.06*3-羧酸異喹啉組1 μmol/kg 10 1.79 ±0.37* 6.04 ±1.01*10 μmol/kg 10 1.75 ±0.18* 8.14 ±0.99*100 μmol/kg 10 1.71 ±0.51* 10.24 ±2.22*IQ-G-OBzl組1 μmol/kg 10 1.68 ±0.22*# 11.81 ±1.99*#10 μmol/kg 10 1.41 ±0.29*# 25.98 ±4.44*#100 μmol/kg 10 1.26 ±0.29*# 33.86 ±4.58*#5-FU組生理鹽水組6 0.88 ±0.25 52.76 ± 8.37

2.2.3 外周血白細胞數量 各組外周血白細胞數比較見表4。

表4 各組外周血白細胞數比較(±s)

表4 各組外周血白細胞數比較(±s)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05;與5-Fu組比較，#P＜0.05;與 IQ-G-OBzl組同劑量比較，ΔP ＜0.05

組別 n 白細胞數量(×109/L)10 4.53 ±0.78 L-甘氨酸芐酯組1 μmol/kg 10 4.68 ±0.39#10 μmol/kg 10 4.42 ± 0.97#100 μmol/kg 10 4.65 ± 0.24#3-羧酸異喹啉組1 μmol/kg 10 4.44 ±0.51#10 μmol/kg 10 4.39 ± 0.73#100 μmol/kg 10 3.41 ± 0.35*#Δ IQ-G-OBzl組1 μmol/kg 10 4.51 ±0.87#10 μmol/kg 10 4.58 ± 0.68#100 μmol/kg 10 4.93 ± 0.94#5-FU組生理鹽水組3.04 ±0.50 6

3 討論

IQ-G-OBzl由 Zheng等［8］發明后并研究證明其對宮頸癌細胞及人早幼粒白血病細胞有良好的抗腫瘤作用，但其對食管癌的研究鮮見報道。本研究選用的Eca-109及EC-9706分別為高分化鱗癌及低分化鱗癌細胞，研究表明L-甘氨酸芐酯、3-羧酸異喹及IQ-G-OBzl對Eca-109及EC-9706體外均有抑制作用，但IQ-G-OBzl組的IC50明顯低于L-甘氨酸芐酯及3-羧酸異喹啉組，而高于5-FU組，表明將L-甘氨酸芐酯及3-羧酸異喹啉化合可以提高抑瘤作用;IQG-OBzl對 Eca-109細胞的 IC50低于 EC-9706細胞株，提示其可能對高分化鱗癌抗腫瘤效果更佳。

本研究結果顯示，隨著L-甘氨酸芐酯、3-羧酸異喹啉及IQ-G-OBzl劑量的升高，裸鼠瘤重降低，抑瘤率升高，IQ-G-OBzl組瘤重低于、抑瘤率高于L-甘氨酸芐酯及3-羧酸異喹啉組，證實IQ-G-OBzl在體內有良好的抑制食管癌作用，與體外研究結果一致。

本研究體內實驗結果顯示，L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組及IQ-G-OBzl組外周血白細胞數及大鼠存活率均高于5-FU組，可能原因為5-FU的毒副作用較大;其外周血白細胞數量與生理鹽水組無明顯差異;但3-羧酸異喹啉組100 μmol/kg干預者外周血白細胞低于生理鹽水組，可能與3-羧酸異喹啉含有苯環結構，可導致骨髓抑制有關。IQ-G-OBzl組外周血白細胞數無明顯降低，可能與氧化喹啉結構可以降低苯導致的骨髓抑制有關，具體機制尚不清楚，需進一步探討。

本研究結果顯示，L-甘氨酸芐酯組、3-羧酸異喹啉組及IQ-G-OBzl組Eca-109及EC-9706內ROS水平均高于生理鹽水組，3-羧酸異喹啉組與生理鹽水組比較無明顯差異;證實IQ-G-OBzl可提高食管癌細胞內ROS的水平，其機制尚不明確;3-羧酸異喹啉無明確升高ROS水平的作用，推測其可能通過其他途徑抑制食管癌細胞生長。IQ-G-OBzl組ROS水平高于L-甘氨酸芐酯組，原因可能是L-甘氨酸芐酯與3-羧酸異喹啉化合物結合后影響了IQ-G-OBzl的立體結構。IQ-G-OBzl組EC-9706細胞內ROS水平低于Eca-109細胞，與體外細胞實驗結果一致。

綜上所述，IQ-G-OBzl體內、外對食管癌細胞均有抑制作用，其作用機制與其可提高細胞內ROS水平有關。IQ-G-OBzl抗食管癌的作用較5-FU低，但其對外周血細胞的影響也較小，且動物模型存活率較5-FU組高，有良好的應用前景。

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