抗VEGF抗體對(duì)人膽管癌移植瘤裸鼠模型的治療作用觀察

馮 亮，李志鈺

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150001)

膽管癌臨床癥狀出現(xiàn)較晚，早期診斷困難，容易向周圍組織浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，外科手術(shù)切除率低，且對(duì)放化療不敏感，預(yù)后較差，3 年生存率 ＜11%［1，2］。深入研究膽管癌的發(fā)病機(jī)制并尋求新的治療途徑是目前研究熱點(diǎn)。Bevacizumab是針對(duì)VEGF的單克隆抗體，可通過阻斷VEGF與受體的結(jié)合而抑制腫瘤組織血管生成，對(duì)肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌血管生成有一定作用［3］，對(duì)肝癌細(xì)胞株也有一定的抑制作用，但其對(duì)膽管癌能否發(fā)揮抗血管生成作用目前鮮見報(bào)道。2012年1～12月，我們觀察了Bevacizumab單克隆抗體對(duì)裸鼠膽管癌血管生成的抑制作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 55只BALB/c-nu裸小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量18～22 g;SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。人膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞株購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司;Bevacizumab(商品名 Avastin)為 Genentech Inc產(chǎn)品;兔抗人VEGF抗體、兔抗人CD34抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 膽管癌移植瘤模型制作及干預(yù) 將QBC939細(xì)胞株(1×106個(gè))接種于小鼠右腋窩皮下。接種后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，腫瘤直徑約0.5 cm(游標(biāo)卡尺測(cè)量)時(shí)即用于實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組15只，藥物1組及藥物2組各20只。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/次，藥物1組及藥物2組分別腹腔注射Bevacizumab 5、10 mg/kg;均每周2次，連續(xù)給藥4周。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 腫瘤體積 治療前及每次治療時(shí)測(cè)量腫瘤體積(=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2)，共8次。

1.3.2 腫瘤組織VEGF表達(dá) 治療結(jié)束后1周處死小鼠取移植瘤組織，常規(guī)步驟制作石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)4 mm切片，采用免疫組化SP法檢測(cè)VEGF表達(dá)。胞質(zhì)棕黃色著色為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%以下為陰性(-);25%～50%為弱陽(yáng)性(+);50%～75%為陽(yáng)性(++);75%以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。(-)與(+)為低表達(dá)，(++)與(+++)為高表達(dá)。

1.3.3 腫瘤微血管密度(MVD) 參考Weidner改進(jìn)方法［4］，以 CD34陽(yáng)性血管數(shù)作為微血管密度(MVD)，先于低倍鏡下(50×)確定熱點(diǎn)處，再于高倍鏡下(200×)任選不重復(fù)的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性血管數(shù)，取平均數(shù)為MVD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用±s表示，治療前后比較采用方差分析，治療后組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

藥物2組用藥3周后小鼠死亡2只，藥物1組及對(duì)照組無死亡。

2.1 腫瘤體積 用藥后各觀察點(diǎn)藥物1組及藥物2組腫瘤體積，但兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但均明顯小于對(duì)照組(P均＜0.05);三組腫瘤體積變化趨勢(shì)見圖1。

圖1 各組用藥第1～4周移植瘤體積變化

2.2 VEGF表達(dá)水平 藥物2組、藥物1組、對(duì)照組 VEGF 陽(yáng)性率分別為 53.5%、56.6%、68.5%，三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;藥物2組、藥物1組、對(duì)照組VEGF高表達(dá)率分別為72%、75%、80%，藥物2組、藥物1組均低于對(duì)照組，P＜0.05。

2.3 MVD 藥物2組及藥物1組MVD分別為23.50 ± 3.23和 23.50 ± 3.23，對(duì)照組為55.86 ±4.73;藥物2組及藥物1組均低于對(duì)照組(P＜0.05)，但藥物2組及藥物1組比較無顯著差異。

3 討論

近年來針對(duì)腫瘤相關(guān)因子的靶向治療成為腫瘤防治的重要策略。由于血管生成對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要作用，使得抗血管生成治療成為一個(gè)獨(dú)立性策略［5］。

血管生成是一個(gè)由已存在的血管內(nèi)皮增殖、遷移，生長(zhǎng)出新毛細(xì)血管的過程。腫瘤血管生成是由包括腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境的共同作用，在特定作用下刺激毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;其中VEGF信號(hào)通路起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞可以分泌VEGF［6，7］，VEGF 與血管內(nèi)皮上的受體(VEGFR)結(jié)合，激活受體自身磷酸化并啟動(dòng)一系列下游信號(hào)活動(dòng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，導(dǎo)致新生血管形成，并改變血管通透性［8，9］，而大量新生血管形成是直徑＞2 mm的腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)必不可少的條件;抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成信號(hào)理論上可阻斷合成血管的必要成分并改變其通透性［5，10，11］。有報(bào)道，40%～60%的膽管癌病例癌組織VEGF呈高表達(dá)，說明VEGF過度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤發(fā)展;有研究認(rèn)為膽管癌組織VEGF的表達(dá)強(qiáng)度與膽管癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有相關(guān)性，VEGF表達(dá)越強(qiáng)，患者的預(yù)后越差［12，13］;故理論上針對(duì)VEGF的治療也能起到抑制血管生成的作用。

Bevacizumab為重組人單克隆抗體，是第一個(gè)在固體腫瘤中顯示出有效性的抗血管生成藥物，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)其用于結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等的治療，特別是對(duì)于晚期腫瘤患者能延長(zhǎng)生存期、提高生存質(zhì)量［14，15］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，兩藥物組腫瘤體積增長(zhǎng)較緩慢，說明Bevacizumab可抑制腫瘤生長(zhǎng);兩藥物組腫瘤中心以及周邊區(qū)域MVD均明顯少于對(duì)照組，說明Bevacizumab具有抑制血管生成的作用，與此前相關(guān)報(bào)道一致［16～18］。Bevacizumab的作用機(jī)制為能夠結(jié)合細(xì)胞外VEGF并阻止其與內(nèi)皮細(xì)胞上受體 (Flt-1及 KDR)結(jié)合，進(jìn)而抑制血管生成［19］。由于Bevacizumab為針對(duì)VEGF的單克隆抗體，也驗(yàn)證了在膽管癌中VEGF異常表達(dá)所導(dǎo)致的促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)作用，同時(shí)證實(shí)了采用抗VEGF抗體阻斷血管生成治療對(duì)于控制膽管癌進(jìn)展的有效性。有報(bào)道認(rèn)為Bevacizumab具有抑制腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［20］，本研究?jī)伤幬锝M腫瘤組織VEGF表達(dá)陽(yáng)性率較對(duì)照組降低，但并不顯著，說明Bevacizumab對(duì)膽管癌的抑瘤作用主要取決于其對(duì)血管生成的抑制作用。

一般認(rèn)為人類對(duì)Bevacizumab的耐受性較好，推薦劑量不會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)。本研究藥物1組未出現(xiàn)明顯的藥物毒性反應(yīng)，但藥物2組出現(xiàn)小鼠死亡的現(xiàn)象，考慮為裸小鼠的耐受量比人低。提示應(yīng)用Bevacizumab時(shí)應(yīng)參考推薦劑量。

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