Tiam1-Rac1在乳腺癌組織中的表達及意義

何雄斌，方 力，胡雄強，吳海燕

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000)

近年來有關乳腺癌侵襲轉移相關因子的作用機制及抑制乳腺癌轉移的分子靶標成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(Tiam1)和Ras相關的C3肉毒素底物1(Rac1)均與乳腺癌的侵襲轉移密切相關，但對二者的相關性及其在乳腺癌侵襲轉移中共同的臨床意義國內外研究鮮見報道。為此，我們進行了如下研究。

1 材料和方法

1.1 材料 2012年1月～2013年8月郴州市第一人民醫(yī)院病理科保存的97例份乳腺癌手術切除的石蠟包埋標本(乳腺癌組)，均經組織病理學確診(患者均為女性，年齡28～72歲，平均45歲;術前均未行化療、放療、內分泌治療;腫瘤直徑≤2 cm者42例，＞2 cm者55例)。病理類型:浸潤性導管癌78例，浸潤性小葉癌12例，髓樣癌4例，黏液癌3例。病理分級:Ⅰ級16例，Ⅱ級52例，Ⅲ級29例;臨床分期:Ⅰ期19例、Ⅱ期43例、Ⅲ期35例;伴腋窩淋巴結轉移者48例。另收集同期正常乳腺組織標本20份(正常組)，乳腺增生標本20份(增生組)。主要試劑:Tiam1兔抗人多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，工作濃度1∶100;兔抗人 Rac1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，工作濃度1∶800。即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus免疫組化檢測試劑盒，購自福州邁新生物技術開發(fā)公司;DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Tiam1及Rac1表達檢測 標本經4%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，石蠟標本連續(xù)切片3張，切片厚度為4 μm，一張行常規(guī)HE染色，另兩張分別行Tiam1、Rac1免疫組化染色，65℃烤片7 h以上后行免疫組化染色，按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗的乳腺癌組織免疫組化染色結果為陰性對照。Tiam1和Rac1蛋白陽性染色為在細胞膜和細胞質中呈現(xiàn)黃色或棕色顆粒，境界清楚，無明顯背景染色。評估標準［1］:①按染色強度計分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分;②按陽性染色細胞百分率計分:高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，共計數(shù)1 000個細胞。陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。①、②計分的乘積為0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，大于5分為強陽性(+++)。最終結果由2位病理醫(yī)師采用用雙盲法判定。

1.2.2 相關性分析 分析Tiam1和Rac1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系、Tiam1和Rac1表達強度與淋巴結轉移的關系及Tiam1與Rac1表達的相關性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0分析軟件。免疫組化數(shù)據(jù)采用χ2檢驗及四格表確切概率法，相關性采用Spear-man等級相關分析。檢驗水準α =0.05。

2 結果

2.1 Tiam1及 Rac1表達 乳腺癌組 Tiam1/Rac1蛋白染色呈淡黃、棕黃或黃褐色陽性顆粒，顏色濃淡不一，不均一分布于癌細胞的胞膜及胞質中;Tiam1以胞質表達為主，胞膜表達不明顯。正常組Tiam1和Rac1蛋白陽性率分別為40%、46% ，增生組分別為35%、30%，乳腺癌組分別為 76.3%、79.4%，乳腺癌組均明顯高于另兩組(P均＜0.01)。

2.2 Tiam1和Rac1表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系 Tiam1和Rac1表達與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、病理類型無關，與腫瘤分級、TNM分期及淋巴結轉移顯著相關。見表1。

表1 Tiam和Rac1表達與乳腺癌病理參數(shù)的關系

2.3 相關性分析 Tiam1與Rac1在乳腺癌組織中的表達呈明顯正相關(r=0.247，P=0.012)，見表2。乳腺癌組Tiam1和Rac1蛋白均陽性者63例，其淋巴結轉移率為65.08%(41/63);Tiam1和Rac1蛋白同時陰性者9例，其淋巴結轉移率為11.1%(1/9)，二者比較P＜0.05。隨Tiam1和Rac1蛋白染色陽性強度的逐漸增強，乳腺癌淋巴結轉移率呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表2 乳腺癌組Tiam1和Rac1蛋白表達的關系(例)

表3 Tiam1和Rac1表達強度與淋巴結轉移率的關系

3 討論

Tiam1基因由荷蘭癌癥研究所Habets等首先由BW5147小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中鑒定出來，定位于染色體21q22.1，其所編碼的蛋白質是目前公認的一種普遍存在的二磷酸鳥嘌呤核苷酸(GDP)與三磷酸鳥嘌呤核苷酸(GTP)轉換因子(GEF)，屬于 Dbl(diffuse B-cell lymphoma oncogenefamily)家族成員之一，是Ras超家族的催化劑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在多種腫瘤細胞系中均明顯高表達，并在惡性腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用。關于其在乳腺癌組織中的表達國內外也有相似報道，Adam等［2］采用蛋白免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在乳腺癌瘤組織中呈過度表達，腫瘤組織分級為Ⅲ級者表達水平明顯高于Ⅱ級者，表明Tiam1的表達與乳腺癌的惡性程度密切相關，吳元清等［3］檢測了126例乳腺癌組織中Tiam1的表達情況，也發(fā)現(xiàn)Tiam1與乳腺癌淋巴結的轉移密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)Tiam1在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織及乳腺增生組織，且Tiam1表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期及淋巴結轉移顯著相關;與文獻報道結果相符。

Rac1屬Rac亞家族，定位于染色體7q22，是Rho蛋白家族中的重要成員，具有與Ras相似的作用，其蛋白全稱為Ras相關的肉毒素底物1，存在失活和激活兩種狀態(tài)，并與細胞移動的關系密切。Rac1的激活可引起一系列下游信號的轉導，如JNK激酶(c-jun N-terminal kinase)、p38蛋白激酶、MAPK(絲裂素活化蛋白激酶)等在細胞骨架重組，細胞黏附與運動，基因表達調控，甚至惡性腫瘤的形成、生長、侵襲、轉移中發(fā)揮重要作用［4，5］。研究顯示在各種細胞外信號刺激下 Tiaml可以特異性地激活Racl，并通過Tiaml/Racl信號轉導通路激活其下游的一系列的信號分子從面發(fā)揮重要的生物學功能。鐘大平等［6］在研究Tiam1和Rac1在大腸癌中的表達時發(fā)現(xiàn)，二者在基因和蛋白水平均呈明顯正相關，并與腫瘤淋巴結轉移、浸潤深度和Duke分期相關。國內眾多學者也在卵巢癌［7］、肺癌、胃癌［8］、食管鱗癌［9］、宮頸鱗癌［10］及骨肉瘤［11］等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Tiam1與Rac1表達呈明確的正相關，還與惡性腫瘤的浸潤、侵襲和轉移密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織及乳腺增生組織相比Rac1在乳腺癌組織中呈高表達，其表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期及淋巴結轉移也顯著相關;二者在乳腺癌的表達中也呈明顯的正相關。為進一步明確二者的關系，我們比較了Tiam1和Rac1均陽性癌患與均陰性的乳腺癌患者的淋巴結轉移率，結果顯示Tiam1和Rac1均陽性者淋巴結轉移率明顯高于均陰性者，提示Tiam1和Rac1蛋白在乳腺癌的侵襲轉移中具有協(xié)同作用。本研究我們還意外發(fā)現(xiàn)隨著乳腺癌Tiam1和Rac1蛋白染色強度的增強，乳腺癌淋巴結轉移率也呈逐漸升高的趨勢。

綜上所述，Tiam1和Rac1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，聯(lián)合檢測Tiam1和Rac1在乳腺癌組織中的表達情況及其陽性強度，對于預測乳腺癌的預后，尤其是乳腺癌的侵襲轉移具有重要的指導意義。

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