金訶子低溫提取物的免疫活性

趙小霞，邱麗君，宣成睿，羅 夏，孫 鵬，楊麗敏

(1天津市第四中心醫(yī)院，天津300140;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué))

訶子又名訶黎勒、訶黎、訶梨、隨風(fēng)子等，為君子科植物訶子及其變種絨毛訶子干燥的成熟果實，其味澀性平，可祛三弊所引起的諸疾，有解毒之功效;而金訶子是蒙藥訶子當(dāng)中的最佳品種，色顯金黃，故名為金訶子［1，2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，訶子由多種糖類、氨基酸、維生素類和大量的鞣質(zhì)等組成，有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、保護肝臟、抗炎、抗癌變、抗增殖、抗輻射、保護心臟、抗關(guān)節(jié)炎、抗過敏、保護胃腸動力和治愈傷口等作用［3～5］。2012年 1 月～2013 年 2月，本研究探討了金訶子低溫提取物對小鼠固有免疫和適應(yīng)性免疫的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:18～22 g昆明鼠，雌雄各半，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物室;健康雄雞購于市場。試劑:金訶子購于內(nèi)蒙古呼和浩特市中蒙醫(yī)院;吉姆薩—瑞特染色液購于北京諾博萊德科技有限公司。儀器:GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海博訊公司;LGJ-18冷凍干燥機購于北京松原興華公司;DZG-303A離子純水機購于美國摩爾公司;YDL5M離心機購于湘儀離心機廠。

1.2 方法

1.2.1 金訶子不同部位提取物的提取及其成分測定 取金訶子1 000 g，粉碎后取990 g加入5 000 mL的超純水，浸泡5 h，放入-25℃的冰箱冷凍，過夜。將冷凍后的金訶子解凍，4 000 r/min、離心40 min，去渣，留上清液，上述方法重復(fù)兩次，將兩次的上清液混合，用不同的分離方法及透析膜分離等技術(shù)分離出5個有效部位，將不同部位的提取液冷凍干燥。具體提取工藝正在專利申請中。將不同部位的提取物在清華大學(xué)分析中心采用紅外光譜技術(shù)進行成分和含量測定。

1.2.2 分組及給藥方式 取昆明鼠170只，隨機分為陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(靈芝多糖)及金訶子不同部位提取物高、中、低劑量組，共17組，每組10只。每天給小鼠灌胃1次，陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予靈芝多糖1.5 mg/(kg·d)，高、中、低劑量組分別給予 25、2.5、0.25 mg/(kg·d)金訶子，連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.2.3 體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 14 d給藥結(jié)束后，第2天晨起通過取小鼠尾部末梢血制片，晾干，吉姆薩—瑞特染色，100倍油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞，計算其中的淋巴母細胞數(shù)和過渡型母細胞所占的百分率，即為淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。

1.2.4 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 于末次給藥7 h后，每只小鼠腹腔注射2%淀粉1 mL。取抗凝的雞血10 mL，加入50 mL生理鹽水，離心洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，末次1 000 r/min離心10 min，棄上清，制成壓積血。吸壓積血2 mL加入198 mL生理鹽水中混勻，制備1%雞紅細胞懸液。第2日晨起每只小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液0.5 mL，輕揉腹部，30 min后脫頸椎處死小鼠，立即剖開腹腔，加入3 mL無鈣鎂的Hangk’s液，輕揉1 min，用移液器吸取腹腔液約2.5 mL，放到離心管中500 r/min離心3 min;倒掉上清液，吸取200 μL滴加在玻片上，涂抹均勻，自然干燥。吉姆薩—瑞特染色，40倍或100倍鏡下觀察，計算吞噬百分率，吞噬百分率=(吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS10.0軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，各項指標(biāo)組間比較采用t檢驗。P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 金訶子不同部位提取物的回收率和物理性狀采用低溫提取和冷凍干燥的方法從金訶子中提取不同部位的成分，最終得到金訶子5個不同部位提取物干粉:分別命名為1號部位、2號部位、3號部位、4號部位、5號部位。990 g的生藥可以提取出(499.8±15.9)g提取物，回收總得率約 50%，其中5個不同部位的回收數(shù)量分別為:1號部位:(129.1±3.3)g、2 號部位:(148.3 ± 5.1)g、3 號部位:(127.7 ±4.3)g、4 號部位:(73.5 ± 3.2)g、5 號部位:(21.2±0.5)g。不同部位成分可完全溶解于水，呈不同色澤和味覺感受。5個提取部位分別采用紅外光譜技術(shù)測定含量，結(jié)果見圖1～5。

圖1 金訶子1號部位提取物紅外光譜圖

圖2 金訶子2號部位提取物紅外光譜圖

圖3 金訶子3號部位提取物紅外光譜圖

圖4 金訶子4號部位提取物紅外光譜圖

圖5 金訶子5號部位提取物紅外光譜圖

2.2 金訶子不同部位提取物對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的影響 淋巴母細胞數(shù)和過渡型母細胞的形態(tài)學(xué)改變?yōu)榧毎w積明顯增大，為成熟淋巴細胞的3～4倍。核膜清晰，核染色質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀。核內(nèi)見明顯核仁1～4個。胞質(zhì)豐富，嗜堿性，有偽足樣突出。胞質(zhì)內(nèi)有時可見小空泡。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率陰性對照組(21.20±3.58)%，陽性對照組(29.40±3.57)%，1號部位低、中、高劑量組分別為(30.10±3.03)%、(36.11 ± 5.09)%、(33.21 ± 2.57)%，2號部位低、中、高劑量組分別為(29.10±6.04)%、(35.25 ±4.02)%、(32.31 ±3.77)%，3 號部位低、中、高劑量組分別為(33.45 ±6.75)%、(34.71 ±4.14)%、(32.67 ±5.77)%，4 號部位低、中、高劑量組分別為(29.93 ±5.12)%、(36.34 ±4.89)%、(30.11 ±3.75)%，5 號部位低、中、高劑量組分別為(37.32 ± 4.25)%、(38.40 ± 5.21)%、(36.23 ±3.78)%。金訶子不同部位不同劑量組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率均高于陽性及陰性對照組(P均＜0.01)。

2.3 金訶子不同部位提取物對巨噬細胞吞噬功能的影響 巨噬細胞吞噬百分率陰性對照組為(19.70±2.68)%，陽性對照組為(27.40 ±3.56)%，1 號部位低、中、高劑量組分別為(33.20 ±6.60)%、(39.23 ±5.32)%、(31.43 ±5.50)%，2 號部位低、中、高劑量組分別為(34.35 ±6.09)%、(39.60 ±7.15)%、(34.38 ±4.67)%，3號部位低、中、高劑量組分別為(31.72±3.99)%、(36.51 ±8.45)%、(33.37 ±6.56)%，4 號部位低、中、高劑量組分別為(31.42 ±4.57)%、(34.32 ±6.57)%、(29.90 ±4.53)%，5 號部位低、中、高劑量組分別為(37.84 ±5.56)%、(41.37 ±4.88)%、(36.53 ±3.56)%。不同部位不同劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率均高于陽性對照組及陰性對照組(P均＜0.01)。

3 討論

中藥是一個極其復(fù)雜的混合物體系，藥材質(zhì)量控制采用中藥的化學(xué)指紋圖譜，該指紋圖譜可以反映藥材所含的全部化學(xué)成分或者大多數(shù)成分的情況，代表了這個中藥的綜合化學(xué)特征。目前紅外光譜因其專屬性強、重現(xiàn)性好、操作方便等優(yōu)勢已成為中藥研究化學(xué)圖譜不可缺少的工具，紅外光譜法在中草藥及中成藥有效成分的含量測定中具有獨特作用［6，7］。本研究采用紅外光譜技術(shù)對其成分進行分析，5個部位圖形相似，各種成分均有，只是含量高低不同。我們猜測正是因為不同成分的含量差別，所以5個部位在低溫時表現(xiàn)出不同的物理性狀、不同的色澤和味覺感。5個部位具體的藥效是否會有不同有待進一步研究。文獻報道，訶子水提物可提高人體的抗體滴度［4］，訶子的粗提物可增強阿米巴肝膿腫倉鼠的細胞免疫應(yīng)答［5］，1 mg/mL訶子常規(guī)熬制成的湯劑可增強小鼠非特異性免疫能力［5］，但文獻中使用的是訶子的熬制湯劑，湯劑的浸泡時間、熬制時間、湯劑中的藥物成分在文獻中均未見報道。而本研究采用低溫提取，優(yōu)化了提取工藝，將成分和含量進行了紅外光譜法的標(biāo)準(zhǔn)化檢測，進一步探討其在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面的作用。通過經(jīng)典的體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗證實，5個部位的金訶子成分均可增強小鼠淋巴細胞功能，且通過經(jīng)典的腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗證實5個部位均可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，不同部位之間對于小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細胞吞噬百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示不同部位之間含量的差別對于免疫增強作用無影響。

總之，本研究提取了金訶子5個部位不同物理性狀、色澤和味覺的成分，并證實其均可增強小鼠的固有免疫和適應(yīng)性免疫。未來的研究將進一步探討5個不同部位成分的抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用，并觀察它們之間的差別，從而為中藥的有效利用、減輕不良反應(yīng)以及成分和藥效之間、成分含量和藥效之間的關(guān)系探索提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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