賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin的表達變化及相關性

魏 紅，齊淑靜，劉文利，徐 亮，李麗東，李 華，董稚明，郭 煒，瞿 峰

(1河北工程大學附屬醫院，石家莊050011;2邯鄲市第四醫院;3河北省腫瘤研究所)

賁門腺癌是我國北方最常見的惡性腫瘤之一，流行病學調查發現，高發區賁門腺癌的發病率和病死率有逐年上升的趨勢。在腫瘤病因學研究中，人們發現Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)具有抑制腫瘤細胞轉移的作用。同時發現上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)在腫瘤細胞凋亡中起作用，但兩者在賁門腺癌中表達及相關性尚無報道。我們檢測了賁門腺癌中RKIP、E-cadherin表達變化，并探討其相關性，為進一步治療賁門腺癌提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008～2013年在河北工程大學附屬醫院手術治療的經病理證實的160例賁門腺癌患者為研究對象，其中男112例、女48例，年齡37～83(61.8±8.7)歲，其中 ＜60歲66例、≥60歲94例。按UICC和AJCC標準進行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期70例、Ⅲ～Ⅳ期90例。按照腫瘤的病理分期進行分級，高分化41例、中等分化54例、低分化65例，所有患者術前未做放化療。

1.2 試劑 RKIP兔多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，兔SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PBS緩沖液購自天津市標準科技有限公司，枸櫞酸修復液購自天津市博迪化工有限公司。

1.3 RKIP和E-cadherin檢測方法 手術取癌原發灶及癌旁非腫瘤組織(距癌組織2～5 cm)，用10%中性甲醛固定標本，脫水包埋，切片，厚度3～4 μm，烤片過夜，脫蠟，高壓熱修復抗原，加一抗，37℃孵育，加二抗，孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片。應用免疫組織化學SP法檢測RKIP和E-cadherin，用已知陽性切片做RKIP和E-cadherin陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。RKIP判斷標準為陽性染色定位于細胞質，以胞質出現均勻棕黃色顆粒定義為陽性細胞。參照Fromowitz評分標準，隨即選取5個高倍視野(×400)計數腫瘤細胞總數和陽性細胞數，得出陽性細胞百分率，當賁門腺癌組織中存在不同分化程度的區域時，選擇同一腫瘤組織切片中占優勢分化程度的腫瘤區域進行計數統計，陽性細胞率≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分;再按多數陽性細胞呈現的染色強度予以計分:無顯色為0分、淺棕黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。將上述兩項得分相加:0分判為“-”、1～2分判為“+”、3～4分判為“++”、5～6分判為“+++”。以“++”和“+++”為RKIP蛋白陽性表達，“-”和“+”為陰性表達。由3名有經驗的臨床病理醫師閱片，根據其評分的平均值確定判定結果。E-cadherin表達定位于細胞膜及細胞質，以細胞膜及細胞質出現黃褐色或淡黃色顆粒為陽性表達，參照紀小尤等提供的免疫組織化學陽性判斷標準，每張切片陽性細胞數≤10%或無陽性著色為陰性，陽性細胞數＞10%為陽性。隨機選擇10個高倍鏡視野(HE×400)，連續計數至少1 000個腫瘤細胞。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗，兩個變量間的關系采用Spearman秩相關分析法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 賁門腺癌及癌旁組織中RKIP、E-cadherin的表達 RKIP和E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達率分別為 38.75%(62/160)和 70.62%(113/160)，而在癌旁非腫瘤組織中的表達率分別為52.50%(84/160)和81.25%(130/160)，RKIP 和 E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達率低于癌旁非腫瘤組織中的表達率(P均＜0.05)。

2.2 賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin的表達及其與臨床病理參數的關系 不同性別、年齡的賁門腺癌組織中RKIP和E-cadherin的陽性表達率差異無統計學意義(P均＞0.05)。不同臨床分期的賁門腺癌組織中RKIP的陽性表達率差異無統計學意義(P＞0.05)，但E-cadherin的陽性表達率差異有統計學意義(P＜0.01)。不同癌組織分化程度及有無淋巴結轉移的RKIP和E-cadherin陽性表達率間差異均有統計學意義(P均＜0.05)。見表1。

表1 賁門腺癌組織中RKIP和E-cadherin表達與臨床病理參數的關系(例)

2.3 賁門腺癌組織中RKIP、E-cadherin表達的相關性 賁門腺癌組織中RKIP表達陰性98例，其中E-cadherin表達陰性15例、陽性83例;賁門腺癌組織中RKIP表達陽性62例，其中E-cadherin表達陰性32例、陽性30例。RKIP和E-cadherin在賁門腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.388，P ＜0.01)。

3 討論

Raf是磷脂酞乙醇胺結合蛋白家族的成員，是高度保守、廣泛表達的小分子胞質蛋白［1］。Yeung等［2］首次發現 RKIP，隨后有研究［3，4］發現 RKIP 不僅可以干擾Raf-1/MEK/ERK信號通路，而且還可以抑制NF-κB和G蛋白偶聯受體激酶等信號傳導過程。2003年Fu等［5］發現人C4-2B轉移性前列腺癌細胞系明顯減低，并且在小鼠中RKIP的表達增加與原發腫瘤血管浸潤的減少和抑制原發腫瘤的生長有聯系。2005年Keller等［6］研究進一步證明，在良性前列腺組織中RKIP表達水平最高，而隨著Gleason評分的增加，前列腺癌組織中RKIP表達水平逐漸減低，在轉移的前列腺癌組織中RKIP的mRNA水平和蛋白水平均低于非轉移的前列腺癌細胞，提示RKIP功能的喪失與前列腺癌的轉移呈正相關。在結直腸癌的研究［7，8］中亦出現相似結論:在有淋巴結轉移的結直腸癌中RKIP低表達，同時RKIP的表達和腫瘤復發和生存率呈負相關。本實驗中RKIP在賁門腺癌組織中比癌旁組織表達明顯降低，RKIP在有淋巴結轉移的賁門腺癌組織中比無淋巴結轉移的組織中表達明顯降低，且RKIP的表達與年齡、性別及臨床分期無關，與之前研究結果基本一致。

研究表明，E-cadherin是鈣黏蛋白家族的重要成員之一，它由723～748個氨基酸組成，其末端位于細胞外，對Ca2+有高度敏感性，而羧基末端位于細胞內，與肌動蛋白相連，由此形成深層蛋白與細胞骨架肌支蛋白相連的黏附層，對于維持細胞形態和調節細胞黏附具有重要作用。當E-cadherin結構和功能發生異常時，其黏附作用降低，細胞容易從原發病灶脫離并逃離而發生侵襲、轉移［9］。E-cadherin能夠抑制腫瘤細胞脫離原發灶，是重要的腫瘤轉移抑制基因之一［10］。本研究中，E-cadherin在賁門腺癌組織中比癌旁組織表達明顯降低，并隨著臨床分期的加深和分化程度的降低其表達明顯降低，在有淋巴結轉移的賁門腺癌組織中比無淋巴結轉移的組織中表達明顯降低，提示E-cadherin的異常表達可能與賁門癌的分化、侵襲和轉移有關。

RKIP和E-cadherin在腫瘤侵襲、轉移中的作用已在乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌等腫瘤中被證實，但兩者在賁門腺癌中的相關性研究尚未見報道。陸身修等［11］發現前列腺癌病例中RKIP表達與E-cadherin的表達呈正相關。本研究通過對160例賁門腺癌中RIKP和E-cadherin表達相關性分析發現:RKIP與E-cadherin的表達呈正相關，說明賁門腺癌組織中RIKP表達下降，E-cadherin表達也下降，使細胞間黏附作用減弱，腫瘤細胞容易脫落，從而增強其轉移能力。RKIP與E-cadherin正相關性機制可能是:RKIP通過干擾Raf-1/MEK/ERK信號通路，促進鋅指因子對E-cadherin的抑制;RKIP可能通過抑制 Raf，影響TGF-β信號通路［12，13］，使Raf和TGF-β信號的協同作用加強，導致E-cadherin的表達下調;基因甲基化致轉錄抑制，鋅指因子與E-cadherin，近端啟動子上的E-box結合，抑制其表達。

綜上所述，RKIP與E-cadherin均是腫瘤轉移抑制因子，在賁門腺癌組織中表達降低，表達的降低能促進賁門腺癌的淋巴轉移并增加其惡性程度，通過聯合檢測有助于臨床早期對賁門腺癌淋巴結轉移進行干預治療，還可以作為賁門腺癌轉移的標志物，對賁門腺癌發展及預后判斷具有重要意義。

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