法舒地爾預(yù)處理對大鼠缺血再灌注損傷肝臟的保護(hù)作用及機(jī)制探討

洪曉鵬，朱耿隆，賈英斌，林志東，張百萌

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)是外科手術(shù)中常見的一種組織器官損傷，常見于肝移植術(shù)后、肝切除術(shù)后以及肝嚴(yán)重創(chuàng)傷術(shù)后等。它是指肝臟在缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血流灌注后出現(xiàn)的肝細(xì)胞功能受損及形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞較缺血前更嚴(yán)重的一種現(xiàn)象［1］。通過各種藥物干預(yù)、缺血前處理、缺血后處理等方法的應(yīng)用，可以明顯減輕肝臟缺血再灌注的損傷。法舒地爾是一種新型鈣離子拮抗劑，同時(shí)也是一種Rho-ROCK信號(hào)通路抑制劑［2］，可以在鼠肝移植的模型中減輕缺血再灌注引起的肝損傷［3］，還可以通過提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力而為大鼠缺血再灌注損傷心肌提供保護(hù)作用［4］。2013年6月2日～2014年3月24日，我們觀察了法舒地爾預(yù)處理對大鼠缺血再灌注損傷肝臟的保護(hù)作用，并探討了其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 成年SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(編號(hào):44008500002403)，給予標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IR組)、法舒地爾組(FAS組)，各10只。各組大鼠以10%水合氯醛(0.2 mL/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)脫毛消毒，以上腹部正中切口入腹，離斷肝周韌帶，解剖出擬阻斷的肝門部血管。之后，F(xiàn)AS組、IR組采用Pringle法，用無損傷血管夾完全阻斷入肝血流，血流阻斷30 min后松開血管夾再灌注2 h，之后取下腔靜脈血及肝臟組織，其中FAS組在阻斷血流30 min前腹腔注射法舒地爾10 mg/kg、IR組于阻斷血流30 min前腹腔注射等量生理鹽水。S組解剖出肝門部血管后不阻斷血流，腹腔注射等量生理鹽水后2 h取下腔靜脈血及肝臟組織。

1.3 血清ALT、AST檢測 取各組大鼠取下腔靜脈血2 mL，全自動(dòng)生化檢測儀檢測血清ALT、AST。

1.4 肝臟組織SOD活性、MDA含量、MPO活性檢測及病理學(xué)觀察 取各組大鼠部分肝臟組織制備勻漿，取上清液，分別用酶標(biāo)儀及分光光度計(jì)測定SOD活性、MDA含量及MPO活性。取各組大鼠部分肝臟組織，用PBS沖洗后固定于10%甲醛中，常規(guī)包埋、切片、HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中ALT及AST水平比較(U/L，±s)

表1 各組大鼠血清中ALT及AST水平比較(U/L，±s)

注:與 S組相比，#P ＜0.05;與 IR 組相比，△P ＜0.05

ALT AST S組組別46.0 ± 4.7 150.8 ±16.7 IR 組 249.9 ±27.4# 550.3 ±25.4#FAS 組 151.3 ±18.8#△ 332.5 ±38.3#△

2.2 各組肝臟組織中SOD活性、MDA含量及MPO活性比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝臟組織中SOD活性、MDA含量、MPO 活性比較(±s)

表2 各組大鼠肝臟組織中SOD活性、MDA含量、MPO 活性比較(±s)

注:與 S組相比，#P ＜0.05;與 IR 組相比，△P ＜0.05

組別 SOD(U/mg pro)MDA(nmol/mg pro) MPO(U/g)S組252.00 ±5.60 2.64 ±0.13 1.66 ±0.13 IR 組 143.72 ±4.48# 12.16 ±1.65# 4.29 ±0.38#FAS 組 182.39 ±6.59#△ 5.72 ±0.72#△ 2.52 ±0.14△

2.3 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變 鏡下可見S組肝細(xì)胞索排列有序，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝細(xì)胞無明顯變性;再灌注2 h，IR組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹、空泡變性，肝竇間隙變窄或消失，可見炎癥細(xì)胞浸潤;再灌注2 h，F(xiàn)AS組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹較IR組減輕，肝竇間隙稍變窄，炎癥細(xì)胞浸潤較IR組少。

3 討論

HIRI的病理生理過程復(fù)雜，其損傷機(jī)制仍未完全明了，主要與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與自噬、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)［5］。在對HIRI機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，越來越多干預(yù)方法如缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理等的應(yīng)用不同程度地提高了肝臟對缺血的耐受性［6］。缺血預(yù)處理可能會(huì)造成血栓形成及相關(guān)臟器血管的損傷，同時(shí)增加手術(shù)時(shí)間、提高相應(yīng)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)等，這些因素的存在也限制了其在臨床上的應(yīng)用與發(fā)展。因此，藥物預(yù)處理的方法越來越得到關(guān)注。法舒地爾是一種新型的蛋白酶抑制劑，擁有廣泛的藥理學(xué)作用［7］。近年來國外有研究［8］表明，法舒地爾可以通過抑制 Rho激酶，減少 Rho-ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化，從而為脂肪肝大鼠缺血再灌注損傷的肝臟提供保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，與S組相比，IR組及FAS組大鼠血清ALT、AST水平升高，而ALT與AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT和AST水平升高，可通過ALT及AST較好地反映肝細(xì)胞急性損傷程度［9］。與IR組相比，F(xiàn)AS組血清ALT、AST水平明顯降低。提示法舒地爾可在一定程度上緩解缺血再灌注引起的肝損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平的高低與機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而SOD是清除氧自由基所必需的酶，其水平的高低則反映機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的能力［10］。本研究結(jié)果顯示，與S組相比，IR組及FAS組SOD活性降低，MDA含量升高。而與IR組相比，F(xiàn)AS組SOD活性升高、MDA含量下降。提示法舒地爾可以通過提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力而為缺血再灌注損傷肝臟提供一定的保護(hù)作用。這也與文獻(xiàn)［4］結(jié)果相符。

HIRI主要包括兩個(gè)階段，前期以Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)為主，而后期以中性粒細(xì)胞介導(dǎo)為主，在炎性細(xì)胞因子和趨化因子的作用下，大量中性粒細(xì)胞在肝內(nèi)浸潤，激活的中性粒細(xì)胞可以釋放出大量的氧自由基，阻塞肝竇，從而使肝竇狹窄甚至閉塞，加重肝臟微循環(huán)障礙，嚴(yán)重?fù)p害肝功能［11］。而MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，中性粒細(xì)胞中MPO含量是固定的，利用此特點(diǎn)分析MPO活性，可間接反映肝組織中中性粒細(xì)胞的浸潤程度［12］。有實(shí)驗(yàn)［13］證實(shí)，通過應(yīng)用法舒地爾可抑制由N-甲酰基-甲二磺酰基-亮氨酰-苯基丙氨酸誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷徙，降低腦組織中MPO活性，通過抑制中性粒細(xì)胞的浸潤而發(fā)揮對缺血腦組織的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用法舒地爾的FAS組肝臟MPO活性較IR組下降，間接說明法舒地爾可以通過抑制中性粒細(xì)胞的浸潤減少氧自由基釋放，而為缺血再灌注損傷肝臟提供一定的保護(hù)作用。

綜上所述，法舒地爾可以明顯提高缺血再灌注損傷后肝臟的SOD活性，降低MPO活性和MDA含量，可能通過提高機(jī)體的抗氧化能力以及抑制中性粒細(xì)胞的浸潤，減少氧自由基的釋放，從而為缺血再灌注損傷肝臟提供一定的保護(hù)作用。其在臨床上的應(yīng)用及對肝臟的具體保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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