NSE在阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中的蛋白表達變化

賈 楠 馬滌輝 常 明 宋月萍 詹 焱 (河北大學，河北 保定 0700)

阿爾茨海默病(AD)具體的病因和發病機制并不明了〔1～3〕。近年來眾多的實驗結果使越來越多的學者認為中樞膽堿能系統損傷可能是各種原因所致癡呆的共同歸宿。乙酰膽堿(ACh)作為中樞神經系統最重要的神經遞質之一，在腦內廣泛存在，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起重要作用。中樞膽堿能神經元數量的減少、ACh合成減少、ACh受體和(或)敏感性降低、ACh通路的解剖異常等都可導致學習記憶功能的障礙。各種動物實驗模型均不能完整模擬人類癡呆的復雜病理及發病機制。每一種模型僅從一種角度驗證某一種假說。機械切斷海馬通路是從膽堿能損傷的角度來設計的。本文通過2-維差異凝膠電泳的技術來檢測膽堿能損傷后的AD大鼠模型腦內蛋白質的改變情況，以期可以檢測一些相關的蛋白改變。

1 材料和方法

1.1 動物模型的制備和標本的留取 實驗動物選取:用水迷宮篩選反應迅速、活躍、健康及清潔級雄性Wistar大鼠，鼠齡3～4個月，體重200～220 g，分籠喂養隨機選取10只為1組(分為正常組、模型組)。大鼠由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。

用10%水合氯醛腹腔注射(0.3～0.33 ml/100 g)麻醉大鼠。將頭部固定在立體定向儀上，剪毛消毒，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，橫斷穹窿海馬傘。上提刀片確定無出血后用骨蠟封閉創口，并在切口處撒少許青霉素粉劑抗炎，縫合皮膚。皮膚切開處給予少許青霉素粉劑，縫合切口即可。動物模型的制備2 w后對不同實驗組大鼠進行morris水迷宮等實驗確定為AD模型制備成功〔4～6〕。所有實驗動物的飼養均依據中華人民共和國科學技術部發布的實驗動物的飼養與使用標準。

1.2 方法

1.2.1 腦蛋白質的提取 造模成功后隨機選取各實驗組Wistar大鼠4只，斷髓取腦，分離海馬。對不同個體選擇同一部位，切取同一大小組織稱重后，在勻漿器中加入10倍量裂解液(30 mmol/L Thiourea，7M 尿素，4%CHAPS，1%蛋白酶抑制劑和核酸酶)，冰浴勻漿，室溫裂解30 min后，15℃ 19 500 r/min離心30 min，收集上清液。應用Clean-up試劑盒去除樣品雜質，然后用2D Quant定量試劑和進行蛋白定量。

1.2.2 熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)實驗鼠海馬蛋白定量后，留取內標。分析膠:對內標蛋白、假手術對照組蛋白、實驗組蛋白分別進行熒光(cy2、cy3、cy5)標記。按標準實驗流程:水化、等電聚焦電泳，采用線性IPG膠條，進行定量蛋白上樣，設定水化及電泳所需條件、此后灌制24×20 cm PAGE膠，此后進行IPG膠條平衡和轉移，電泳儀垂直電泳。

1.2.3 圖像分析統計學處理 Typhoon 9400激光掃描儀于熒光模式下進行成像掃描，掃描后的圖像文件用DeCyder差異分析軟件，找出差異表達蛋白點。蛋白的表達和匹配使用DeCyder-BP及DeCyder-BVA軟件進行，進行統計學處理(蛋白點含量升高或降低20%以上認為有差異)。選取有意義蛋白點進行質譜分析。

2 結果

正常組大鼠與AD模型組大鼠海馬的蛋白點分析比較，此蛋白在AD模型組中表達增強，AV Ratio為1.45，出現率為100%(P＜0.05)。蛋白點從在制備膠上切下，進行質譜分析，在NCBI上進行蛋白鑒定，經鑒定為神經元烯醇化酶(NSE)。見圖 1，圖 2。

圖1 質譜分析

圖2 兩組大鼠海馬蛋白點分析

3 討論

AD作為神經系統退行性病變，一直是眾多學者研究的熱點，進行性的智能減退是本病的特點，膽堿能損傷是公認的致病因素之一〔4～6〕。我們在對正常大鼠及AD模型大鼠的2-維差異凝膠電泳的海馬組織實驗中檢測到NSE含量的明顯變化。此結果在兩組模型大鼠的海馬、額葉的免疫組織化學實驗中同樣得到證實〔5〕。

烯醇化酶在生物體內的糖酵解代謝途徑中發揮著廣泛的作用。其同工酶共五種:Q Q、B B、Y Y、Q B、Q Y，由免疫學性質不同的Q、B、Y三種亞基組合組成。已有實驗證實烯醇化酶同工酶均存在于胞質中。其中在神經元及特定的神經內分泌細胞中存在的只有Y Y型的NSE。NSE在腦組織細胞的活性最高，外周神經和神經分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經組織、血清和腦脊液。它被發現在與神經內分泌組織起源有關的腫瘤中，導致血清中NSE明顯升高。NSE主要作為一種腫瘤標志物用來檢測小細胞肺癌，60%～81%小細胞肺癌病例的血清中NSE濃度升高〔7，8〕。雖然NSE濃度與轉移部位沒有相關性，但是與臨床分期、療效的評價及預后均有很好的相關性。此外多數的神經母細胞瘤患者的血清NSE很高，且與病情預后相關。陽性率可達96% ～100%，測定血清NSE對該類腫瘤的早期診斷及預后判斷具有較高的臨床價值。另外，血清NSE升高還可見于甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細胞瘤、轉移性精原細胞癌、黑色素瘤、胰腺內分泌瘤等〔9～11〕。

膽堿能損傷可引起智能改變。而檢測智能改變的臨床指標是多種的智能量表:癡呆量表 MMSE、HIS、ADL(20項)等。但量表分析受患者受教程度、理解能力以及個體的差異等多種因素影響。臨床腦電分析、神經病理等也不能廣泛推廣。如果臨床上可以通過腦脊液或血液中某種特定指標的檢測，來動態的判定疾病的進程、治療后的恢復程度、疾病的轉歸及預后;將對臨床疾病的診斷和治療起到一定的幫助作用。通過反復動物實驗，我們觀察到NSE的變化;鑒于NSE的存在特殊性，當神經元受到損傷后，NSE從細胞內溢入，可進入腦脊液和血液。而腦組織中膠質細胞和其他神經組織不含NSE，那NSE是否也可以作為檢測腦損傷嚴重程度的客觀指標，從另一角度反映神經功能的缺失、智能改變的情況，是我們關心的問題，我們將對部分智能改變患者進行臨床實驗，以期可以尋找到有力的實驗室證據，為AD的臨床診斷和治療提供幫助。

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