姜黃素對人結腸癌細胞HT-29中β-catenin、血管內皮生長因子的影響

賈 佳 趙 逵 張銀萍 陳 濤 盧光新 (湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 563003)

姜黃素是從中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗腫瘤、降血脂、抗炎、利膽、抗氧化等作用，且長期應用無明顯毒副反應〔1〕。多年臨床研究表明，姜黃素在抗腫瘤方面具有很好的發展前景〔2〕。美國國立腫瘤研究所已將其列為第3代腫瘤化學預防藥物〔3〕。大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發病率及病死率呈上升趨勢，目前居惡性腫瘤死亡率第3位〔4〕。研究證明，在腫瘤的侵襲、轉移過程中，相關基因β-catenin和血管內皮生長因子(VEGF)發揮了極其重要的作用〔5〕。本實驗觀察姜黃素對人結腸癌HT-29細胞增殖的影響及β-catenin、VEGF蛋白表達的變化。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 姜黃素、MTT(Sigma公司);胎牛血清、改良型1640培養基、胰蛋白酶(Hyclone公司);二甲基亞砜(DMSO)(貴陽恒因生物);VEGF引物、β-catenin引物、β-actin引物、β-catenin多克隆抗體(兔來源)(上海生工生物工程上海服務有限公司);BCA法蛋白定量試劑盒、辣根酶標記鼠抗兔IgG(H+L)(北京博奧森生物技術有限公司);β-actin多克隆抗體(小鼠來源)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人結腸癌細胞株HT-29購自中科院上海細胞所，細胞培養:結腸癌細胞HT-29，接種于含10%胎牛血清改良型1640培養基中培養，置于37℃、5%CO2、100%溫度的培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至對數生長期時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測姜黃素對HT-29細胞增殖的抑制 取對數生長期的HT-29細胞，實驗組分為量效組和實效組，設空白組、陰性對照組、實驗組，調整細胞濃度為2.0×106個/ml，接種于96 孔板中，藥物處理組分別加入 5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L，設5個復孔，對照組加入培養基，培養48 h，每孔加入20 μl 0.5%的 MTT溶液，繼續培養4 h，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，酶標儀讀取A490值，細胞生長抑制率(%)=(1－用藥組A值/對照組A值)×100%，計算出IC50。時效組種板同量效組，加藥時以IC50為參照，96孔板加入不同濃度的姜黃素 18、21、24 μmol/L，分別測藥物干預 12、24、36、48、60 h的MTT，得到相應的吸光值。所有試驗重復3次。

1.2.3 Western印跡法檢測HT-29細胞中β-catenin、VEGF蛋白的表達 用21 μmol/L姜黃素處理HT-29細胞，培養6、12、24和48 h，并設陰性對照，提取總蛋白后，再用BCA定量試劑盒進行總蛋白定量，然后上樣、電泳、轉膜、封閉，加一抗雜交(β-catenin、VEGF、β-actin)及相應二抗，暗盒中曝光后進行顯影和定影，以β-actin校正作相對量分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 姜黃素對人結腸癌細胞HT-29的抑制率 MTT實驗顯示不同藥物濃度、不同作用時間對人結腸癌細胞HT-29有抑制作用。實驗組與對照組比較A值差異均有統計學意義(P＜0.05)。同陰性對照組對比，隨著濃度的增加，OD值隨之降低，存在量效關系(圖1)。由A490處測得的吸光值，并測得姜黃素對HT-29細胞的IC50(半數抑制濃度)為19.27 μmol/L。3種不同劑量的姜黃素作用于HT-29細胞，隨著時間的延長，濃度越大的，抑制率越高，存在時效關系(圖2)。

圖1 不同濃度姜黃素對HT-29細胞48 h生長增殖的影響(n=4)

2.2 姜黃素對HT-29細胞中VEGF、β-catenin蛋白表達的影響 姜黃素濃度21 μmol/L干預 HT-29細胞6 h、12 h、24 h和48 h時VEGF、β-catenin蛋白均較對照組表達逐漸降低(圖3)，其余組與陰性對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖2 姜黃素作用不同時間對HT-29細胞的抑制率(n=4)

圖3 姜黃素作用HT-29細胞后VEGF、β-catenin蛋白的表達

表1 姜黃素作用于HT-29細胞后VEGF、β-catenin蛋白的表達(n=4，s)

表1 姜黃素作用于HT-29細胞后VEGF、β-catenin蛋白的表達(n=4，s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

-catenin對照組組別 VEGF β 1.22±0.23 0.97±0.16 6 h 0.91±0.211) 0.77±0.131)12 h 0.68±0.181) 0.55±0.161)24 h 0.44±0.191) 0.38±0.131)48 h 0.21±0.102) 0.24±0.132)

3 討論

在1815年在姜黃根莖中首次分離得到姜黃素〔6〕，半個世紀后，姜黃素的晶體被首次制得。二十世紀八十年代，Kuttan等〔7〕報道姜黃素可能具有潛在抗腫瘤活性，但多年都不被關注，1995年之后，大量的實驗才顯示其抗腫瘤的活性〔8～10〕。近年來，不斷地體外實驗證明，姜黃素能夠抑制多種腫瘤細胞株生長、增值并誘導其凋亡。陳建等〔11〕應用MTT和Western印跡實驗方法發現姜黃素能夠抑制結腸癌SW480細胞，其機制可能是抑制Akt的磷酸化并下調survivin蛋白。羅強等〔12〕應用人結腸癌SW620細胞，采用CCK8和流式細胞儀檢測法發現，姜黃素可誘導結腸癌細胞凋亡。本實驗用MTT法又一次證實，姜黃素能夠抑制體外結腸癌HT-29細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性，存在時效與量效關系。

β-catein是新原癌基因的產物，分布于細胞膜和胞質，一方面維系著細胞的緊密連接，同時從細胞膜進入胞質后，作為信息傳遞介質可激活結腸癌癌變中起重要作用的Wnt通路，因此在結腸癌中處于高表達〔13〕，而正常的結腸上皮細胞質中沒有游離的β-catenin。VEGF是迄今所發現的最重要的促血管生成因子，通過促進新生血管的生成參與腫瘤的發生、發展〔14〕。VEGF也可通過自分泌和旁分泌的直接間接兩種方式，影響腫瘤浸潤和轉移〔15，16〕。VEGF隨著腫瘤增殖、侵襲加深和出現轉移而表達明顯增高，大量的體外實驗研究還顯示VEGF可誘導血管內皮細胞產生的間質膠原酶既滿足血管新生對基質降解的要求，也有助于腫瘤細胞從組織的脫落，侵入血管，浸潤周圍臟器或發生遠處轉移，這間接證明了VEGF參與了腫瘤的增殖、侵襲和轉移等發展過程〔17，18〕。Wnt/β-catenin 通路和 VEGF是抗癌藥物作用的新靶點，而姜黃素是通過阻斷通路中的相關因子而起到治療大腸癌的作用。

本實驗結果說明姜黃素可能是通過抑制β-catenin從而影響Wnt通路，進而抑制HT-29細胞的增殖。VEGF蛋白表達的下降說明姜黃素有可能抑制了VEGF促進腫瘤新生血管的作用，這與Shankar等〔19〕研究說明姜黃素能抑制腫瘤的生長轉移和血管發生相符。

綜上，結腸癌的發生、發展、增殖及侵襲與 VEGF及 βcatenin有密切的關系，姜黃素抑制VEGF和β-catenin蛋白的表達，可能是其抑制結腸癌增殖的機制之一，而兩種蛋白表達的影響之間的相互關系不明確，兩者對結腸癌發生機制是獨立還是協同作用有待進一步研究。

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