HPLC法測定患者血漿中氯吡格雷的羧酸代謝產(chǎn)物濃度

劉麗娜，夏泉，黃燕，許杜娟1，#（1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥3003；.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 3003；3.國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 3003）

氯吡格雷（Clopidogrel）（結(jié)構(gòu)式見圖1 A）是一種新型的噻吩并吡啶類衍生物，具有抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。其作用機(jī)制是通過選擇性地與血小板表面ADP受體結(jié)合來抑制血小板的聚集，目前已被廣泛應(yīng)用于冠脈支架植入（PCI）術(shù)中、術(shù)后以預(yù)防急、慢性血栓形成[1]。氯吡格雷為前體藥，在體內(nèi)約有85%被水解成無活性的羧酸氯吡格雷（CCA，結(jié)構(gòu)式見圖1 B），而不足15%被代謝為活性的硫醇衍生物。此前藥及其活性硫醇衍生物極不穩(wěn)定，且濃度極低，在血漿中用常規(guī)檢測方法很難檢測到[2]。CCA相比其前體藥和活性代謝產(chǎn)物，是氯吡格雷在體內(nèi)的主要組成部分，常用于做氯吡格雷的生物等效性及藥動(dòng)學(xué)研究[2-4]。本研究旨在建立用高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）法測定人血漿中CCA的濃度，該方法具有簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為臨床應(yīng)用及個(gè)體化治療方案提供參考。

1 材料

1.1 儀器

圖1 氯吡格雷及CCA結(jié)構(gòu)式A.氯吡格雷；B.CCAFig 1 Chemical structures of clopidogrel and carboxylic acid metabolite of clopidogrelA.clopidogrel；B.carboxylic acid metabolite of clopidogrel

Ailgent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，配DAD-G1315 B檢測器、1100色譜工作站（美國Ailgent公司）；AB135-5電子天平（上海梅特勒多-托利多公司）；XW-80 A旋轉(zhuǎn)振蕩器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；TGL-185高速冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

CCA對(duì)照品（加拿大TRC公司，含量：98%，批號(hào)：3-JHY-32-3）；內(nèi)標(biāo)：苯妥英鈉對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100210-200401）。甲醇、乙睛為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。健康人血漿由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，CCA血漿樣品取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院服用氯吡格雷的患者。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀（三乙胺調(diào)pH至5.7）-乙腈（78∶22）；流速：1.0 ml/min；柱溫：50℃；紫外檢測波長：220 nm；進(jìn)樣量：20μl。

2.2 儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取CCA對(duì)照品和苯妥英鈉對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為100 μg/ml的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品預(yù)處理

精密吸取患者血漿200μl，置于1.5 ml具塞圓底塑料離心管中，加內(nèi)標(biāo)苯妥英鈉儲(chǔ)備液10μl，渦旋混勻2 min，加6%高氯酸50μl渦旋混勻2min。以離心半徑為8cm、14000r/min離心10 min，取上清液再次以離心半徑為8 cm、14000 r/min離心10 min，取上清液置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣20μl。

2.4 色譜行為

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，CCA和苯妥英鈉的保留時(shí)間分別為7.6、19.8 min。CCA和苯妥英鈉與血漿中其他組分色譜峰分離良好，理論板數(shù)為3000，分離度（R）＞1.5，色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+CCA+苯妥英鈉；C.患者血漿；1.CCA；2.苯妥英鈉Fig 2 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+CCA+phenytoin sodium；C.plasma；1.CCA；2.phenytoin sodium

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍考察

用空白血漿將CCA儲(chǔ)備液稀釋成0.10、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml的系列溶液。按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測定，記錄色譜。以血藥濃度（x）為橫坐標(biāo)、所測藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：y＝0.1499 x+0.0551（r＝0.9995）。結(jié)果表明CCA血藥濃度在0.10～8.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限為0.05 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質(zhì)量濃度的含對(duì)照品血漿，每一質(zhì)量濃度平行操作5份，于同日內(nèi)按“2.3”項(xiàng)方法操作后進(jìn)樣分析，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d按此法操作，綜合5d的數(shù)據(jù)計(jì)算日間精密度。CCA日內(nèi)、日間RSD均小于10%，方法精密度良好，結(jié)果見表1。

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 方法回收率：分別配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質(zhì)量濃度的含對(duì)照品血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，每一濃度平行操作5份后進(jìn)樣分析，代入回歸方程計(jì)算濃度，以測得量和加入量的比值計(jì)算方法回收率。結(jié)果CCA的方法回收率在99.7%～100.2%之間，確保了定量的準(zhǔn)確性和可靠性，見表1。

2.7.2 提取回收率：分別配制0.5、2.0、4.0μg/ml的CCA低、中、高3種質(zhì)量濃度的含對(duì)照品血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，每一濃度平行操作5份后進(jìn)樣分析。另配制與血漿中相同濃度的CCA對(duì)照品溶液，與樣品中含量相等的CCA比較，記錄峰面積計(jì)算提取回收率。結(jié)果提取回收率均大于75%，見表1。

表1 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery tests（n＝5）

上述結(jié)果表明，日內(nèi)、日間RSD均小于3%，平均方法回收率在99.7%～100.2%之間，平均提取率均大于75%。該方法適用于本品血藥濃度檢測和藥動(dòng)學(xué)研究。

2.8 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

用空白血漿配制0.5、2.0、4.0 μg/ml的CCA低、中、高3種質(zhì)量濃度的含對(duì)照品樣品，在－40℃冰箱中冷凍后取出，在0、24、48、72h后按“2.3”項(xiàng)下方法測定CCA的濃度。結(jié)果CCA低、中、高3種質(zhì)量濃度測得值的RSD分別為1.0%、2.1%、1.18%，穩(wěn)定性RSD均小于10%，表明樣品在－40℃條件下穩(wěn)定。

2.9 患者血藥濃度檢測

從門診及住院病房共收集到15例PCI術(shù)后規(guī)律服用氯吡格雷75 mg/d超過7 d的患者，患者在當(dāng)天早上服藥后3 h時(shí)采集血樣測其CCA血藥濃度，結(jié)果見表2。

表2 患者CCA血藥濃度測定結(jié)果Tab 2 Plasma concentration results of CCAin patients

3 討論

本研究建立了以HPLC-UV法測定血漿中羧酸氯吡格雷的濃度，方法專屬性高，方法回收率在99.7%～100.2%之間，提取回收率超過75%，穩(wěn)定性RSD均小于10%，符合藥動(dòng)學(xué)和生物等效性的要求[2-4]。因此測定CCA的血藥濃度可以對(duì)研究氯吡格雷體內(nèi)過程以及指導(dǎo)氯吡格雷進(jìn)行個(gè)體化給藥提供幫助。

氯吡格雷羧酸代謝產(chǎn)物的測定方法目前有HPLC法及液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）法等。本研究使用HPLC法，其中流動(dòng)相中用三乙胺調(diào)pH可增加儀器靈敏度。試驗(yàn)過程中曾比較二氯甲烷、正乙烷、乙醚、6%高氯酸萃取CCA，發(fā)現(xiàn)6%高氯酸萃取率最高。與文獻(xiàn)報(bào)道[4]方法相比，本法具有以下特點(diǎn)：（1）樣品預(yù)處理較為簡單；（2）和文獻(xiàn)中1.7 ml/min的流速相比，該研究流速較低從而使CCA和血漿中雜質(zhì)峰充分分離。

氯吡格雷藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程中，其吸收和代謝過程受ATP結(jié)合盒（ABCB）1及細(xì)胞色素P450酶（CYP）酶單核苷酸多態(tài)性（SNP）的影響，基因分型不同其CCA的血藥濃度也有所差別。另合并用藥的相互作用、年齡、體質(zhì)量，患者生活習(xí)慣及肝腎功能也會(huì)影響其血液濃度[5]。

[1]Jolanta M，Siller-Matula，Katrin Haberl，et al.The effect of antiplatelet drugs clopidogrel and aspirin is less immediately after stent implantation[J].Thrombosis Research，2009，123（6）：874.

[2]Zydus Research Centre，Bioanalytical and DMPK Department，Sarkhej-Bavla N.H.Estimation of carboxylic acid metabolite of clopidogrel in Wistar rat plasma by HPLC and its application to a pharmacokinetic study[J].Journal of Chromatography B，2005，25（821）：173.

[3]Robinson A，Hilis J，Neal C，et al.The validation of a bioanalytical method for the determination of clopidogrel in human plasma[J].Journal of Chromatography B，2007，27（848）：344.

[4]Bahrami G，Mohammadi M，Sisakhtnezhad S，et al.Highperformance liquid chromatographic determination of inactive carboxylic acid metabolite of clopidogrel in human serum：application to a bioequivalence study[J].Journal of Chromatography B，2008，28（864）：168.

[5]Zhou HM，Meng S，Zhao J，et al.Influence of genetic and non-genetic factors on the plasma concentrations of the clopidogrel metabolite（SR26334）among Chinese patients[J].Clinica Chimica Acta，2013，416（1）：50.