來氟米特聯合貝那普利對糖尿病腎病大鼠腎組織TGF-β1和CTGF表達的影響

孟 宇 金海峰 鄭海蘭 姜玉姬 李錦姬 金 華 (延邊大學附屬醫院腎內科，吉林 延吉 33000)

糖尿病(DM)腎病(DN)作為是DM最常見、最嚴重的微血管并發癥之一，DN引起的終末期腎病發病率呈逐年上升的趨勢。DN特征性的病理變化為腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、細胞外基質(ECM)聚集、系膜區增寬，病變進展最后可導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化。目前認為轉化生長因子(TGF)-β1、結締組織生長因子(CTGF)是DN腎小球硬化形成過程中的重要生長因子。大量研究已證實應用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)主要通過阻斷血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的生成，從而阻斷腎素-血管緊張素系統(RAS)對于保護腎臟、緩解腎小球、腎小管炎癥、減少早期DN患者蛋白尿，延緩小管間質纖維化和腎小球硬化有顯著的療效〔1〕;來氟米特(LEF)是一種新型的免疫抑制劑，近年臨床研究表明，淋巴樣增強因子具有抗炎、抗增殖作用，可以降低DN患者尿蛋白排泄量，保護腎臟、延緩腎功能進展，但具體機制尚不明確。兩者聯合應用可能更好地保護腎臟功能，延緩DN進展。本實驗通過觀察聯合應用來氟米特及ACEI貝那普利對DN大鼠腎臟病理改變及TGF-β1和CTGF表達的影響，研究在DM早期聯合應用免疫抑制劑來氟米特及ACEI貝那普利是否更能明顯延緩DN的發生及發展過程。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 來氟米特(商品名為愛諾華)由蘇州長征-欣凱制藥有限公司提供，貝那普利(商品名為洛汀新)由北京諾華制藥有限公司提供。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1和CTGF抗體、細胞免疫組化法(SABC)免疫組織化學試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物分組與模型制備 取體重180～200 g的Wistar雄性大鼠(由延邊大學醫學部動物科提供)53只，按晝夜時程平衡飼料喂養，自由飲水、進食，經1 w喂養適應期后，測定血糖均正常。禁食12 h后，隨機取5只大鼠作為正常對照組(NC，n=5);其余48只大鼠一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg，溶于pH 4.5，0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液，冰浴新鮮配制)，NC 組注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。48 h后取大鼠尾尖血，測血糖值均≥16.7 mmol/L，DM模型成功。NC組血糖正常。將模型組大鼠隨機分成對照組(DN組)、貝那普利組、來氟米特組，貝那普利+來氟米特組(聯合用藥組)，各12只。造模成功第2天起，貝那普利組每天給予貝那普利(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，來氟米特組每天給予來氟米特(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，聯合用藥組每天給予來氟米特(10 mg·kg-1·d-1)和貝那普利(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，NC組與DN組每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.3 標本收集及生化指標 在實驗第4、8、12周末測體重;將大鼠置于清潔的代謝籠中，收集24 h尿，測量24 h尿蛋白排泄量(24 h UPE)、尿肌酐(Ucr);采用乙醚吸入麻醉后，用毛細玻璃管在大鼠眼眶后靜脈采血1.5 ml左右，測血糖(Glu)、血肌酐(Scr)，計算內生肌酐清除率(Ccr)。由于Ccr受體表面積的影響，采用Ccr/體重(kg)加以校正。Ccr(ml·min-1·kg-1)=尿肌酐(μmol/L)×每分鐘尿量(ml/min)/〔血肌酐(μmol/L)/體重(kg)〕

1.4 病理學檢查 (1)在實驗第12周末無水乙醚麻醉后切取大鼠雙腎，剝離雙腎被膜，生理鹽水沖洗殘余血跡，濾紙吸干，電子天平稱量左腎重量，將雙腎沿矢狀面剖開，放入4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，行過碘酸雪夫氏染色(PAS)、TGF-β1和CTGF免疫組化染色的光鏡樣品制備。(2)免疫組織化學染色(TGF-β1和CTGF):切片厚4 μm，以酒精梯度常規脫蠟至水;含3%H2O2的甲醇室溫孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶;高壓修復抗原;加入1∶100稀釋的兔抗鼠單克隆抗體，置濕盒中4℃過夜;1∶100稀釋生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育25 min;二氨基聯苯胺(DAB)顯色:1 ml蒸餾水加入試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間5～10 min;蘇木素輕度復染細胞核，脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察腎組織細胞質內有棕褐色顆粒者為陽性。每批均設有陰性對照。采用雙盲法在光鏡下隨機選擇20個腎小球/片，計數腎小球的陽性細胞數及細胞總數，TGF-β1和CTGF在腎小球細胞中的標記值為陽性細胞數/細胞總數。

1.5 統計學方法 應用SPSS11.5軟件進行LSD-t檢驗和單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 不同時期各組大鼠空腹血糖(Glu)的比較 NC組在各時期Glu均維持在正常范圍，DN模型組、貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組大鼠各時期均≥16.7 mmol/L，與NC組比較具有顯著差異(P＜0.01);同期DN模型組、貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組大鼠血糖相比，無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 不同時期各組大鼠體重的比較 在實驗第4、8、12周末測空腹體重，與NC組比較，其余各組大鼠體重均明顯降低(P＜0.01);8、12 w末貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組體重均高于DN模型組(P＜0.05)，其中聯合用藥組更為明顯(P＜0.01);12 w末聯合用藥組體重高于單用貝那普利或來氟米特(P＜0.05)。見表1。

2.3 12 w末各組大鼠左腎重、腎重指數的比較 與NC組比較，其余各組大鼠左腎重、腎重指數均明顯增加(P＜0.01);與DN組比較，貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組腎重指數均有所下降(P＜0.05)，其中聯合用藥組下降最為明顯(P＜0.01)。見表2。

表1 不同時期各組大鼠體重的比較(s，g)

表1 不同時期各組大鼠體重的比較(s，g)

與 NC 組比較:1)P＜0.01;與 DN 模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與貝那普利組比較:4)P＜0.05;與來氟米特組比較:5)P＜0.05;表2、表3 同

293.42±16.26 351.12±29.06 399.12±9.54 DN 模型組 235.67±12.491) 253.84±13.331) 272.14±15.031)貝那普利組 249.83±12.691) 287.29±28.621)2) 311.16±29.061)3)來氟米特組 251.27±16.521) 289.26±21.571)2) 308.60±28.491)3)聯合用藥組 253.19±13.791) 291.08±18.171)3)325.11±28.981)2)4)5)NC組

表2 12 w末各組大鼠腎重、腎重指數比較(s)

表2 12 w末各組大鼠腎重、腎重指數比較(s)

組別 左腎重(g)腎重指數(×103)1.11±0.15 2.79±0.43 DN 模型組 1.50±0.971) 5.54±0.531)貝那普利組 1.48±0.141) 4.79±0.651)3)來氟米特組 1.46±0.091) 4.78±0.251)2)聯合用藥組 1.38±0.101) 4.26±0.401)3)4)5)NC組

2.4 不同時期各組大鼠24 h UPE比較 與同期NC組比較，DN模型組、貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組大鼠24 h UPE顯著增加(P＜0.01);隨著時間延長，24 h UPE逐漸增多，8 w末聯合用藥組較DN模型組減少(P＜0.05);12 w末與DN模型組比較，貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組24 h UPE均減少(P＜0.05);與單用貝那普利或來氟米特比較，聯合用藥組24 h UPE明顯減少(P＜0.05)。見表3。

2.5 不同時期各組大鼠Ccr的比較 與同期NC組比較，DN模型組、貝那普利組、來氟米特組及聯合用藥組Ccr升高(P＜0.05)，隨著時間的延長，同期各用藥組較DN模型組降低，12 w末聯合用藥組較DN模型組顯著降低(P＜0.05)。見表4。

2.6 腎組織中TGF-β1、CTGF表達的變化 見表5，圖1，圖2。TGF-β1和CTGF在正常組大鼠腎小球和腎間質內無或極少表達。與NC組比較，TGF-β1和CTGF在DN組大鼠腎小球上皮細胞、毛細血管襻、系膜區、腎小管上皮細胞及間質細胞均有強烈表達(P＜0.01)，各用藥組大鼠腎小球系膜區亦有表達，但較DN組弱;聯合用藥組表達較貝那普利組和來氟米特組更減弱(P＜0.05)。

表3 不同時期各組大鼠24 h UPE比較(s，mg)

表3 不同時期各組大鼠24 h UPE比較(s，mg)

NC組11.13±5.12 10.45±2.29 9.98±1.46 DN 模型組 40.42±2.661) 49.52±4.221) 56.98±4.651)貝那普利組 36.05±7.011) 41.03±10.701) 46.53±7.971)3)來氟米特組 39.29±12.641) 43.36±9.911) 48.08±10.091)2)聯合用藥組 31.04±5.271) 34.78±5.131)2)41.83±4.501)2)4)5)

表4 不同時期各組大鼠Ccr水平比較(s，ml·min－1·kg－1)

表4 不同時期各組大鼠Ccr水平比較(s，ml·min－1·kg－1)

與 NC 組比較:1)P＜0.05;與 DN 模型組比較:2)P＜0.05

4.63±0.40 4.52±0.51 4.38±0.57 DN 模型組 6.53±0.671) 6.31±0.781) 6.08±0.491)貝那普利組 6.24±0.721) 6.05±0.621) 5.62±0.531)來氟米特組 6.30±0.691) 6.09±0.711) 5.68±0.491)聯合用藥組 6.27±0.621) 5.98±0.551) 5.49±0.391)2)4 w 8 w 12 w NC組組別

表5 各組大鼠腎小球TGF-β1、CTGF平均光密度值比較(s)

表5 各組大鼠腎小球TGF-β1、CTGF平均光密度值比較(s)

與 NC組比較:1)P＜0.01;與 DN 模型組比較，:2)P＜0.01;與貝那普利組比較:3)P＜0.05;與來氟米特組比較:4)P＜0.05

組別 TGF-β1(OD值)CTGF(OD值)0.016±0.003 0.014±0.005 DN 模型組 0.184±0.0251) 0.189±0.0231)貝那普利組 0.137±0.0171) 0.142±0.0201)來氟米特組 0.146±0.0191) 0.151±0.0231)聯合用藥組 0.070±0.0042)3)4) 0.080±0.0092)3)4)NC組

圖1 腎組織中TGF-β1免疫組化表達的變化(×400)

圖2 腎組織中CTGF免疫組化表達的變化(×400)

3 討論

TGF-β1是目前公認的促腎臟纖維化作用最強的因子，對于DN發生腎小球硬化、腎間質纖維化起重要作用〔2〕。研究證實在DN早期TGF-β1水平就已經升高，TGF-β1通過以下途徑參與DN的發生發展:①刺激腎小管上皮細胞、系膜細胞、成纖維細胞分泌(ECM)成分(如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等);抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)合成，促進金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)和組織纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)合成，從而促進ECM合成，減少ECM降解，導致ECM在腎小球系膜區大量聚積〔3〕。②抑制腎小球系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞以及近曲小管上皮細胞的增殖分化，即使細胞停滯在 G1期，導致腎臟體積變大。CTGF是20世紀90年代Zhang等〔4〕從人臍靜脈內皮細胞培養液中分離得到的，它屬于即刻早期反應基因(CCN)家族，是一種富含半胱氨酸、由349個氨基酸組成的細胞因子。CTGF廣泛存在于多種組織器官，以腎臟的含量最高，腎小球系膜細胞、上皮細胞、腎間質成纖維細胞等均可分泌。CTGF作為介導TGF-β1促纖維化活性的下游調節因子，正常生理條件下呈低表達或無表達，某些病理條件下，CTGF則過度表達參與纖維化疾病的發生，例如腎纖維化、肺纖維化等。發生DN時，高血糖、晚期糖基化終末產物(AGEs)、血流動力學異常、AngⅡ合成增多以及TGF-β表達上調等因素均可誘導CTGF表達上調〔5〕。CTGF可直接誘導腎小球系膜細胞(MC)肥大，亦可通過TGF-β途徑間接誘導MC周期素依賴激酶(CDK)抑制劑(CDKIs)合成，后者可阻止細胞周期由G1期進入S期即細胞周期停滯在G1期，從而發生細胞肥大，也是DN早期腎小球肥大的發生原因之一;CTGF還可以上調ECM成分(FN、Ⅰ型、Ⅳ型膠原蛋白)的表達，通過增加組織TIMP-1、TIMP-3的表達，而阻止ECM的降解，參與DN晚期腎小球硬化的形成〔6，7〕。TGF-β1 和 CTGF 與 DN 的發生、發展有著密切的聯系，尋找有效藥物阻斷其合成表達或抑制其活性，可防治或延緩DN進展。

DN使AngⅡ合成增加，降解減少，它通過血流動力學和非血流動力學雙重作用參與DN的發生發展。①血流動力學:選擇性收縮腎小球出球小動脈，使腎小球囊內壓增高，UPE。②非血流動力學:通過促進硫酸肝素糖蛋白轉運，破壞基底膜電荷屏障，增加腎小球毛細血管通透性，導致尿蛋白增加;AngⅡ還可以直接誘導腎小球系膜細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞等分泌多種炎癥因子，如 TGF-β、VEGF、TNF 等〔8〕。ACEI能抑制AngⅠ向AngⅡ轉換，使AngⅡ合成減少，因而ACEI治療DN具有腎臟保護的作用。本實驗結果與上述理論相一致。

來氟米特是一種新型的、具有抗增殖活性的免疫抑制劑，目前已被廣泛應用于治療自身免疫性疾病和免疫介導性疾病，如系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、難治性腎病綜合征、類風濕關節炎、IgA腎病以及器官移植術后出現排斥反應等，并取得良好的療效。因來氟米特具有免疫抑制及抗增殖作用，且低毒性、耐受性好、半衰期長、價格便宜，應用領域不斷擴大，臨床上已經應用于治療DN。付宇等〔9〕將來氟米特用于治療表現為大量蛋白尿的DN患者，結果顯示患者UPE明顯減少。這說明來氟米特有減少尿蛋白、保護腎臟的作用，但具體機制途徑尚不明確。本實驗證實來氟米特可以下調腎組織TGF-β1和CTGF的表達，考慮這是其保護腎臟的途徑之一。

本研究結果提示來氟米特和貝那普利可減輕DN大鼠腎小球高濾過、高灌注、高壓力狀態，從而減輕DN早期腎臟肥大，并可以通過減少尿蛋白而起到保護腎臟的作用，且聯合用藥效果更佳。另外TGF-β1、CTGF確實參與DN的腎損害，貝那普利和來氟米特可以通過減少TGF-β1、CTGF在DN腎組織的表達而有效地保護腎臟，并且聯合用藥效果更為明顯。

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