HPLC法測定奧拉西坦原料藥中的有關物質

劉憲勇，劉世軍，孫克明，張 敏，畢文超，王 巖（武警山東總隊醫院藥劑科，濟南 250014）

奧拉西坦是由意大利ISF公司于1974年首先合成的吡咯烷酮類衍生物，為新一代腦代謝改善藥，其口服制劑和注射制劑分別于1987年和1990年在意大利首次上市。本品適用于輕中度血管性癡呆、老年性癡呆以及腦外傷等引起的記憶與智能障礙[1-3]，其不良反應少[4]、耐受性好[5]。國家食品藥品監督管理局試行標準中的奧拉西坦原料藥有關物質檢查分別采用的是以色譜柱為氰基柱和C8的高效液相色譜（HPLC）法[6-7]，另有文獻報道采用色譜柱為多聚物柱[8]、氨基柱的HPLC法。由于奧拉西坦合成工藝不同所引入的雜質如合成原料[甘氨酰胺鹽酸鹽和4-氯乙酰乙酸乙酯（CEA）]、中間體（4-氯-3-羥基丁酸乙酯）、副產物等不同，因此為控制按本文中合成路線合成的奧拉西坦原料藥的質量，筆者參考奧拉西坦含量及有關物質檢查方法[9-12]建立了色譜柱為C18、流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH至3.0）等的HPLC法。結果表明，建立的色譜分析方法能夠檢出更多的雜質，且該色譜柱成本低。因此，最終確定本試驗建立的HPLC法作為測定奧拉西坦原料藥中有關物質的限量檢查方法。

奧拉西坦的合成路線見圖1。

圖1 奧拉西坦的合成路線圖Fig 1 Synthesis route of oxiracetam

1 材料

1.1 儀器

日立L-7100型HPLC儀、L-7420紫外檢測器（日本日立公司）；LC-20AT HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

甘氨酰胺鹽酸鹽（武漢銀河化工有限公司，批號：08-220，化學純）；CEA（青島寒冰化工有限公司，批號：08-220，化學純）；中間體（批號：Z100901）、奧拉西坦原料藥粗品（批號：C100903）、奧拉西坦原料藥精品（批號：110201、110301、110302，純度：99.8%、99.9%、99.8%）均為本院自制；奧拉西坦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101032-200901，純度：99.7%）。

2 色譜條件的選擇

流動相Ⅰ：參考奧拉西坦試行標準[6]，以甲醇-水（2∶3）為流動相Ⅰ。

流動相Ⅱ：參考文獻[12]，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH至3.0）為流動相Ⅱ。由于此流動相中緩沖鹽的濃度較高，易造成色譜柱堵塞，因此不采用此流動相。

流動相Ⅲ：經大量試驗篩選確定以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH至3.0）為流動相Ⅲ。

色譜柱：月旭XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：214 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μl。

在流動相Ⅰ條件下，甘氨酰胺鹽酸鹽、奧拉西坦峰與中間體峰保留時間分別為2.115、3.130、4.445 min，奧拉西坦的色譜峰保留時間太小，不能有效檢驗出樣品中的雜質。故選擇在流動相Ⅲ條件下，進行方法學考察試驗。

3 方法學考察

3.1 系統適用性試驗

精密稱取甘氨酰胺鹽酸鹽、CEA、中間體和奧拉西坦對照品適量，加流動相稀釋成質量濃度分別約為30、5、10、10 μg/ml的溶液，作為分離度試驗溶液。精密量取此溶液20 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。

由圖2結果表明，奧拉西坦色譜峰與相鄰雜質峰均能有效分離，采用該色譜條件，可有效檢出奧拉西坦原料藥中合成原料及中間品殘留，故初步確定此色譜條件為有關物質檢查的色譜條件。

圖2 系統適用性試驗色譜圖1.甘氨酰胺；2.奧拉西坦；3.中間體；4.CEAFig 2 Chromatograms of system suitability test1.glycinamide；2.oxiracetam；3.intermediate；4.CEA

3.2 破壞試驗

稱取奧拉西坦原料藥精品（批號：110201）約11 mg 6份，分別置于10 ml量瓶中，分別進行如下處理：（1）加流動相溶解；（2）加入1 mol/L的鹽酸溶液2.0 ml，室溫放置2 h，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至中性；（3）加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 ml，室溫放置3 min，立即用0.5 mol/L鹽酸溶液調節pH至中性；（4）加入30%雙氧水2.0 ml，室溫放置1 h（另取流動相同法操作，作為氧化破壞空白溶液）；（5）于沸水中加熱8 h，冷卻至室溫；（6）置于4500 lx的光照條件下，照射48 h。上述各處理后溶液均加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液分別作為破壞前溶液及酸、堿、氧化、高溫、強光破壞后溶液。

分別精密量取上述溶液各20 μl，注入色譜儀，色譜見圖3，各分離指標結果見表1[其中分離度指主峰與最近雜質峰的分離度，物料平衡結果＝（破壞后峰總面積×破壞前稱樣量）/（破壞前峰總面積×破壞稱樣量）]。

由圖3和表1可見，本品經酸、堿、氧化、高溫、強光破壞試驗，破壞出的各雜質峰均能與主峰完全分離，主峰純度良好，不包含其他色譜峰；物料平衡結果表示，破壞試驗中破壞出的雜質都能有效檢出，表明該色譜條件適用于本品有關物質檢查。確定采用該色譜條件進行奧拉西坦原料藥有關物質檢查。

3.3 線性關系試驗

稱取奧拉西坦對照品10.14 mg置于100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml置于100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。分別精密量取上述貯備溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖。以質量濃度（c，μg/ml）為橫坐標，以峰面積（A）為縱坐標，用最小二乘法計算回歸方程及相關系數，得線性方程：A＝29538c+134.4（r＝0.9997，n＝5）。結果表明，奧拉西坦檢測質量濃度線性范圍為0.2104～0.6312 μg/ml。

3.4 精密度試驗

稱取奧拉西坦對照品10.23 mg，置于10 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為溶液a；精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為溶液b。精密量取上述溶液各20 μl分別注入色譜儀，記錄色譜圖，每份溶液重復進樣6次。結果，溶液a和溶液b峰面積的RSD分別為0.31%和0.12%（n＝6），表明精密度良好。

圖3 破壞試驗色譜圖A.酸破壞后溶液；B.堿破壞后溶液；C.氧化破壞后溶液；D.高溫破壞后溶液；E.強光破壞后溶液；F.破壞前溶液；1.奧拉西坦Fig 3 Chromatograms of destory testA.solution destroyed by acid；B.solution destroyed by base；C.solution destroyed by oxidation；D.solution destroyed by heat；E.solution destroyed by light；F.solution undestroyed；1.oxiracetam

表1 破壞試驗各指標結果Tab 1 Evaluation results of destroy test

3.5 穩定性試驗

取“4”項下供試品溶液（批號：110201）分別于0、2、4、6、8 h進樣記錄色譜圖，計算主峰面積和雜質的RSD。結果，主峰峰面積的RSD＝0.67%、最大單個雜質峰面積的RSD＝2.28%、總雜質的RSD＝4.90%（n＝5）。表明測定溶液在放置過程中雜質不斷增大，因此確定本品測定溶液配制后須立即進樣。

3.6 定量限和檢測限試驗

取奧拉西坦對照品，精密稱定，用流動相逐步稀釋并取樣檢測，按信噪比約為3、10時分別得出奧拉西坦檢測限、定量限為0.95、3.95 ng。

4 樣品中有關物質測定

稱取奧拉西坦精品適量，用流動相制成約1.0 mg/ml的溶液作為供試品溶液；精密量取供試品適量，用流動相逐步稀釋成0.01 mg/ml的溶液，作為對照溶液。在上述確定的色譜條件下，分別精密量取上述溶液各20 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，用主成分自身對照法測定雜質含量。結果3批樣品（批號：110201、110301、110302）的最大單個雜質量分別為0.02%、0.03%、0.03%，總雜質量分別為0.02%、0.03%、0.03%。

5 討論

采用現有的奧拉西坦質量標準中的方法，檢測到的雜質數量少，對合成的中間體和降解產物無法有效分離和檢出。本文所建立的奧拉西坦有關物質檢查方法（與標準方法的區別只是流動相和色譜柱）條件下，奧拉西坦出峰時間適中，流動相中緩沖鹽濃度較小，有關物質測定中各雜質峰與奧拉西坦峰能有效分離；本文提到的合成工藝中可能引入的工藝雜質及破壞試驗中的降解雜質不影響奧拉西坦雜質的測定。

綜上所述，采用本色譜條件進行有關物質測定，方法準確、簡便，專屬性強，靈敏度高，能有效控制奧拉西坦原料藥中的有關物質。

[1]劉治軍，胡欣.促智藥奧拉西坦的臨床和基礎研究[J].中華神經外科疾病研究雜志，2005，4（3）：286.

[2]Nicolaus BJR.Chemistry and pharmacology of nootropics[J].Drug Dev Res，1982，2（6）：463.

[3]Soldtos CTM.CNS effects of ISF2522，a new nootropic[J].Curr Ther Res，1979，26（7）：525.

[4]孫琛.臨床用藥大全[M].北京：中國大百科全書出版社，1995：106.

[5]於冬暉，焦效蘭，周玉娟，等.國產奧拉西坦膠囊的人體耐受性及藥代動力學研究[J].中國臨床藥理學雜志，1997，13（1）：11.

[6]國家食品藥品監督管理局.WS-1005（X-750）-2002奧拉西坦：試行[S].2003-01-28.

[7]國家食品藥品監督管理局.YBH06612003 奧拉西坦：試行[S].2003-09-27.

[8]Lecaillon JB，Souppart C，Leduigou F，et al.Determination of oxiracetam in plasma and urine by column switching high-performance liquid chromatography[J].Chromatogr，1989，497（6）：223.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄29.

[10]鐘明康，張靜華，陸叢笑.高效液相色譜法測定血漿中格列吡嗪的濃度[J].中國臨床藥學雜志，1999，8（3）：172.

[11]閆小燕，胡欣，曹國穎.高效液相色譜法測定奧拉西坦氯化鈉注射液中主藥的含量[J].中國藥房，2006，17（8）：618.

[12]湛建峰，黃海偉，劉朝霞，等.HPLC法測定奧拉西坦氯化鈉注射液中奧拉西坦含量及其有關物質[J].藥物分析雜志，2009，29（12）：2077.