HPLC法同時測定帕羅醇中的4種光學異構體含量

郭文敏，鄭利剛，邢 浩，白曉雪[.石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司，石家莊 050035；.石家莊職業技術學院，石家莊 05008]

帕羅醇有2個手性中心，共有4個光學異構體，反式左旋帕羅醇是帕羅西汀合成中的關鍵手性起始原料；而根據開發立體異構體新藥的技術要求[1]，需要對手性起始原料的所有光學異構體進行嚴格控制，以確保終產品藥物的安全性、有效性、質量可控性。文獻[2]中報道的方法只能檢測順式與反式2對非對映異構體，不能同時檢測帕羅醇中可能存在的4個光學異構體（A反式左旋帕羅醇、B反式右旋帕羅醇、C順式右旋帕羅醇、D順式左旋帕羅醇），因而有必要首先建立一套適合的分析方法對A的3種光學異構體雜質進行有效控制。為此，本研究建立了同時測定帕羅醇中4種光學異構體的含量方法，報道如下。

1 材料

1.1 儀器

UV-2201紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

帕羅醇4種異構體對照品（包括A、B、C、D，批號分別為：111201、111202、111203、111204，純度分別為：97.68%、97.19%、98.66%、96.39%）均為石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司拆分、精制、標定；A原料藥[石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司自制，批號：120101、120102、120103，含量：99.56%、99.69%、99.91%]；正己烷、異丙醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

對照品溶液：分別精密稱取A、B、C、D 4種異構體對照品各10.0 mg，各置于100 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為100 μg/ml的對照品溶液；將4種異構體對照品溶液按1∶1∶1∶1混合，即得4種異構體的混合對照溶液。

供試品溶液：分別精密稱取3批A原料藥各10.0 mg，分別置于100 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 測定波長的選擇

分別以流動相為溶劑將A、B、C、D 4種異構體對照品配制成一定質量濃度的溶液，在190～400 nm波長內進行掃描。結果表明，各異構體在267 nm波長處均有較強的吸收，故選擇其作為檢測波長。

2.3 色譜條件

色譜柱為CHIRALPAK?IC-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），以硅膠表面共價鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料；流動相為正己烷-異丙醇-二乙胺（65∶35∶0.1），流速為1.0 ml/min；檢測波長為267 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μl。

2.4 方法專屬性考察

分別精密量取A、B、C、D 4種異構體的對照品溶液及其混合對照溶液各10 μl，進樣測定，記錄色譜圖。結果，A、B、C、D的保留時間分別為6.856、7.635、14.103、28.319 min，理論板數分別為12696、8186、9295、8029，兩兩間分離度分別為2.1、3.6、5.1，拖尾因子均小于1.15，空白溶劑不干擾測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 線性關系試驗

分別精密稱取4種異構體A、B、C、D對照品各適量，用流動相依次稀釋制成含每個手性單體質量濃度約為5.0、10、20、50、80、100、120 μg/ml的溶液，進樣測定，以峰面積（A）對質量濃度（c）進行線性回歸，得4種異構體的線性方程，見表1，結果表明4種異構體檢測質量濃度線性范圍均為5～120 μg/ml。

2.6 檢測限試驗

取上述對照品溶液，逐級稀釋至信噪比≥3時，4種異構體的檢測限均為10 ng。

2.7 回收率試驗

按“2.1”項下方法稱取已知4種異構體含量的供試品各9份，分別加入含4種異構體為高、中、低3個質量濃度的對照品溶液各3份，進樣測定，計算各個異構體的回收率。4種異構體A、B、C、D的回收率試驗結果見表2。

2.8 溶液穩定性試驗

分別取各異構體對照品溶液于室溫下放置，于0、2、4、6、8 h進樣測定。結果各異構體的峰面積在8 h內RSD均小于0.4%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.9 重復性試驗

稱取批號為120101的樣品6份，分別配制成供試品溶液，進樣測定，結果表明本方法重復性良好，詳見表3。

表2 回收率試驗結果（%%，n＝3）Tab 2Results of recovery test（%%，n＝3）

表3 重復性試驗結果（%%，n＝6）Tab 3Results of repeatability test（%%，n＝6）

2.10 樣品中異構體含量測定

分別稱取3批樣品配制成供試品溶液后進樣測定，結果見表4，色譜見圖1⑥（批號：120103）。

表4 3批樣品中異構體含量測定結果（%%）Tab 4 Results of content determination of enantiomers in 3 batches of samples（%%）

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本研究前期試驗中分別以蛋白質型、多糖衍生物型、硅膠表面共價鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯等為填料的手性色譜柱進行4種異構體檢測方法的摸索。結果表明，以蛋白質型為填料的色譜柱的色譜峰形較差，無法有效分離4種手性異構體；以多糖衍生物型為填料的色譜柱雖然能夠分離4種異構體，但要異構體A和B達到分離度大于1.5以上的理想分離，異構體D的保留時間將在90 min以上，且柱效較差，不適合含量測定使用。故本研究最終選擇了以硅膠表面共價鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料的色譜柱，結果4種異構體均達到基線分離，分析時間為30 min，4種手性異構體色譜峰的理論板數均在8000以上，適合于快速、準確測定4種異構體含量的要求。

3.2 流動相的選擇

以硅膠表面共價鍵合有纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯為填料的色譜柱，選用正己烷-異丙醇為流動相時，由于帕羅醇為含醇羥基的化合物，故在流動相中加入堿性改性劑二乙胺可以顯著地改善色譜峰的保留行為、分離度及柱效。通過對正己烷-異丙醇-二乙胺比例分別為66∶34∶0.1、65∶35∶0.1、64∶36∶0.1的流動相進行篩選，最終選擇以正己烷-異丙醇-二乙胺（65∶35∶0.1）為流動相。試驗表明此流動相下4種異構體在較短的時間內達到基線分離。

本研究另對流速及柱溫進行了考察，結果發現流速的改變對異構體的分離影響不大，為減少分析運行時間，選擇流速為1.0 ml/min；柱溫由15℃升高到40℃，雖然保留時間由60 min減少到35 min，但異構體A和B的分離度由2.9降低到1.45，綜合比較，選擇柱溫為25℃。

綜上，本研究經采用不同手性色譜柱、不同流動相體系、不同流動相調節劑（二乙胺、三氟乙酸、甲酸等）對4種異構體進行色譜條件與系統適用性試驗，優化確定了同時測定4種異構體含量的準確、快速的HPLC法條件。本研究成功地實現了對反式左旋帕羅醇光學異構體（A）雜質的有效控制，對提高用其作為原料合成的藥品帕羅西汀的安全性、有效性、質量可控性具有促進作用。

[1]黃曉龍.美國FDA關于開發立體異構體新藥的政策簡介[J].中國新藥雜志，2000，9（9）：650.

[2]郭文敏，白曉雪，梁亞麗，等.HPLC法同時測定帕羅醇中反式帕羅醇和順式帕羅醇的含量[J].中國藥師，2011，14（11）：1570.