氨基酸構型對多肽納米纖維體內分布的影響*

徐宏艷 張玉民 楊翠紅 劉金劍 褚麗萍 閆玉軍 劉鑒峰 宋娜玲

自組裝多肽納米纖維因其良好的生物相容性、合成簡單、易于設計及修飾等優點受到生物醫學研究領域學者的廣泛關注，已被用做三維細胞培養基質[1-2]、組織工程[3-4]以及藥物的緩控釋載體[5-6]等。早期研究的自組裝多肽納米材料主要是由天然氨基酸即L構型氨基酸組成，但天然氨基酸組成的多肽在體內應用時存在降解速率過快、穩定性差的問題，最近幾年已有學者將可以抵抗體內蛋白酶降解的D構型自組裝多肽應用到體內研究中[7-8]。氨基酸構型的不同很可能對其體內分布代謝產生影響，進而影響到其體內的應用。由于體內大量蛋白和多肽的干擾，外源多肽在體內難以通過常規手段檢測其含量，因此目前尚鮮見不同構型氨基酸組成的多肽自組裝納米纖維在體內分布代謝差異的報道。放射性核素標記技術可將放射性核素標記到外源多肽上，通過檢測放射性信號即可確定外源多肽在體內的分布及含量，從而排除體內蛋白等的干擾[9]。本研究利用125I對不同構型氨基酸組成的多肽進行標記，自組裝成納米纖維后注射入小鼠體內，系統地研究氨基酸不同構型對其自組裝形成的納米纖維體內分布的影響，為不同構型氨基酸組成的多肽在醫學領域應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 2-氯三苯甲基氯樹脂和芴甲氧羰基（Fmoc）-氨基酸（吉爾生化上海有限公司）；哌啶、N,N′-二甲基甲酰胺、N,N-二異丙基乙胺、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯、三氟乙酸、二氯甲烷、乙醚等試劑（天津凱通化學試劑有限公司）；電鏡銅網、醋酸雙氧鈾（北京中鏡科儀技術有限公司）；Na125I（放射性比活度為12.95 GBq/mL，無載體，美國PE公司）；氯胺-T，偏重亞硫酸鈉（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；BALB/c小鼠，雌性，體質量（20±2）g（北京軍事醫學科學院）。

1.1.2 主要儀器 小動物活體成像儀（IS in vivo FX，美國KODAK公司）；全自動γ計數儀（2470 WIZARD2，美國Perki?nElmer公司）；放射性薄層掃描儀（AR2000，美國BioScan公司）；1H核磁共振（VARIAN Unity Plus 400 MHZ，美國Varian Instruments公司)；質譜儀（Finnigan LCQ AD，美國Thermo公司）；透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20系統，美國FEI公司)；高效液相色譜（HPLC，北京綠綿科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多肽合成及表征 利用2-氯三苯甲基氯樹脂通過固相多肽合成方法制備Nap-GFFYGRGD和Nap-GDFDFDYGRGD（F和Y為D構型氨基酸）。制備過程如下：首先將樹脂加到固相合成器中，在無水二氯甲烷中充分溶脹。然后將第一個Fmoc保護的氨基酸（D）用無水二氯甲烷溶解，加入偶聯劑N,N-二異丙基乙基胺，轉移到上述固相合成器中，在室溫下反應1 h。向固相合成器中加入封閉液（無水二氯甲烷∶N,N-二異丙基乙基胺∶無水甲醇體積比為17∶1∶2），室溫反應10 min，然后加入含哌啶體積百分比為20%的N,N－二甲基甲酰胺溶液脫第一個氨基酸的Fmoc保護基團。將需要加入的第二個Fmoc保護的氨基酸（G）用N,N－二甲基甲酰胺溶解，加入羧基活化劑苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯和偶聯劑N,N-二異丙基乙基胺，轉移至固相合成器中室溫反應2～3 h。按照上述方法依次加入需要反應的氨基酸。最后一個氨基酸反應完畢后，加入三氟乙酸與無水二氯甲烷（體積比為1∶99）混合液反應10 min，將多肽鏈從樹脂上切下。旋轉蒸發濃縮，加入2次甲苯以除去殘留的三氟乙酸，用油泵抽干后得到粗品。用高效液相色譜進行分離提純，通過核磁共振和高分辨率質譜對多肽進行表征。

1.2.2 多肽自組裝與形貌觀察 用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.4）制備濃度為3 g/L的L-肽和D-肽溶液，于玻璃試管中加熱至沸騰，自然冷卻至室溫即得到自組裝的L-纖維和D-纖維溶液。分別取以上2種多肽纖維溶液10 μL至銅網上，用醋酸雙氧鈾染液染色5 s即制得透射電鏡樣品。將樣品放置干燥器內過夜干燥，用于透射電鏡觀察樣品微觀形貌。

1.2.3 多肽125I標記、純化及鑒定 多肽的125I標記采用氯胺-T法。將100 μg多肽粉末用50 μL PBS完全溶解后加入0.5 mCi Na125I和50 μL氯胺-T溶液（1 g/L），室溫震蕩反應5 min，再加入50 μL偏重亞硫酸鈉溶液（0.2 g/L）終止反應。取1 μL反應液點至硅膠板上，以V乙醇∶V水=9∶1為展開劑，采用放射性薄層掃描儀對薄層板進行掃描，計算標記率。剩余反應液通過放射性HPLC進行純化。分別取2 μL純化后的溶液進行薄板層析及薄層掃描，測定標記化合物的放化純度。

1.2.4125I-多肽體外穩定性檢測 分別取50 μL純化后的125I-Nap-GFFYGRGD和125I-Nap-GDFDFDYGRGD溶液，加入到200 μL人新鮮血清中，37℃培養箱中孵育72 h，分別在12、24、48和72 h取樣并采用1.2.3中的方法測定其放化純度。

1.2.5 組織分布 采用抽簽的方式將BALB/c小鼠隨機分為125I-Nap-GFFYGRGD和125I-Nap-GDFDFDYGRGD組，每組12只，分4個時間點取材，每個時間點3只。將125I標記的2種多肽納米纖維溶液按1.85×104Bq/g劑量經尾靜脈注射入小鼠體內，分別在注射后1、3、6和12 h進行眼球取血，脫頸處死后分別取心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、肌肉和腦，稱質量并利用γ計數儀檢測各組織中的放射性活度，計算放射性攝取率，以每克組織放射性占注射量的百分比（%ID/g）表示。

1.3 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析，計量數據采用±ss表示，進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多肽分子結構及納米纖維形貌 多肽分子結構式見圖1。透射電鏡結果顯示2種多肽均可自組裝成納米纖維，纖維直徑約為10～20 nm，纖維長度為微米級，且L-纖維和D-纖維的微觀結構未見明顯差異，見圖2。

Figure 1 The molecular structures of Nap-GFFYGRGD and Nap-GDFDFDYGRGD圖1 多肽Nap-GFFYGRGD和Nap-GDFDFDYGRGD的分子結構式

Figure 2 TEM images of peptide nanofibers圖2 多肽自組裝納米纖維的透射電鏡圖

2.2 多肽125I標記及穩定性 因多肽序列中含有酪氨酸殘基，因此可以將125I連接到酪氨酸的羥基苯環的鄰位上對多肽進行標記。結果顯示2種多肽均具有較高的標記率，標記率均在80%以上，見圖3。對標記多肽進行純化后的放化純度均在98%以上，可以滿足體內實驗的要求。通過體外穩定性實驗可以初步判斷125I標記的多肽在體內是否容易出現125I脫離的現象。結果顯示標記化合物在體外具有良好的穩定性，72 h的血漿穩定性在90%以上，見圖4。微量的125I脫離不會對檢測結果帶來明顯影響。

Figure 3 The TLC images of iodine-125 labeled peptides圖3 125I標記多肽純化前后放射性薄層掃描圖

Figure 4 The result of in vitro stability of125I-Nap-GFFYGRGD圖4 125I-Nap-GFFYGRGD體外穩定性結果

2.3 組織分布比較 結果顯示2種納米纖維在血液中第1、3和6 h差異有統計學意義，在注射后1 h D-纖維的血液濃度高于L-纖維，之后較迅速地從血液中清除，3 h、6 h的血液濃度顯著低于L-纖維；而L-纖維在注射后6 h內的血液濃度基本保持穩定，但至12 h時較快衰減，兩種纖維血液濃度差異無統計意義，見表1。L-纖維和D-纖維在組織中的分布差異有統計學意義。L-纖維在胃中大量聚集，各個組織中的放射性含量在前6 h的變化較小，而D-纖維則在肝中大量分布，其次是腎和大腸，各組織中放射性含量隨時間變化明顯，較迅速地消除，見表2。

Table 1 The blood concentration of peptide nanofibers表1 多肽納米纖維不同時間的血藥濃度（%ID/g，x±s）

3 討論

3.1 多肽納米纖維在生物醫學領域的應用 多肽納米纖維是一類新的生物醫用材料，其疏水端通過疏水相互作用力聚集在一起，而親水端伸展在水相中形成環形結構，通過環形結構的不斷延伸組裝成長的纖維。不同濃度的多肽納米纖維有不同的功能：高濃度納米纖維可以形成水凝膠，用于三維細胞培養、再生醫學中的組織填充物；而低濃度的納米纖維可以形成溶液，用作疏水性藥物的載體來提高藥物溶解度、靶向輸送藥物等。多肽納米纖維作為藥物載體的研究主要集中在抗腫瘤藥物載體的應用方面。美國西北大學的Stupp等[10]將兩親性多肽分子（peptide amphliphile，PA）自組裝形成的多肽納米纖維包載疏水性抗癌藥物喜樹堿，通過靜脈注射治療荷瘤小鼠，結果顯示其顯著抑制了小鼠腫瘤的生長。加拿大滑鐵盧大學的Chen等[11]將由聚乙二醇（PEG）修飾的多肽分子AAP8-DEG形成的納米纖維通過疏水作用包載抗癌藥物玫瑰樹堿，通過增加玫瑰樹堿在生理環境中的穩定性提高了藥效。以上研究結果表明多肽納米纖維是一類潛在的臨床抗腫瘤藥物輸送載體。

Table 2 The distribution of nanofibers in different organs表2 多肽納米纖維的組織分布 （n=3，%ID/g，x±s）

3.2 D構型氨基酸用于提高多肽納米材料的體內穩定性 由于體內存在大量的蛋白酶，可以識別并降解由天然的L構型氨基酸所組成的多肽和蛋白，因此會造成由L構型氨基酸所組成的納米材料在體內過早地崩解，從而造成所包裹藥物的過早釋放。為解決多肽在體內被酶降解的問題，已有研究者將非天然的D構型氨基酸引入到多肽序列中，用于體內研究并取得了一定的成果[12-13]。但目前對D構型氨基酸組成的自組裝多肽納米纖維在體內的分布代謝情況仍鮮見報道，鑒于D構型氨基酸自組裝形成的多肽納米纖維正被逐步應用到體內研究中，有必要研究其在體內的分布規律來進一步指導其在生物醫藥領域的應用。

3.3 不同構型多肽纖維的體內分布差異 本文以125I為示蹤劑對比了由2種氨基酸序列相同，但部分氨基酸構型不同的多肽所組成的納米纖維在小鼠體內的分布規律。結果表明2種納米纖維的體內分布存在差異，L構型纖維主要分布于胃中，而D構型纖維則主要分布于肝中。可能的原因是D構型纖維體內由于缺少相關的降解酶，因而一直維持著較大的結構，大分子更容易被網狀內皮系統（RES）所捕獲并進入肝中。以上結果對指導多肽納米纖維的體內應用具有一定的價值。

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