HIF-1α在間歇低氧合并肺氣腫大鼠肝細胞凋亡中的機制研究*

戰京燕 陳懷永 吳 琦△ 孫 昕 馮 靖 李 雪 徐 龍 包翠萍

呼吸重疊綜合征是阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA） 和慢性阻塞性肺疾病（COPD）共存的疾病[1]，間歇低氧(IH)和肺氣腫是其主要的病理學基礎[2-3]。流行病學研究顯示成年男性中呼吸重疊綜合征的患病率近1%，其并發癥和死亡率均較高[1]。這些研究表明呼吸重疊綜合征并非OSA和COPD的簡單疊加，但是可以確定的是患者的低氧狀態進一步加重[4]。低氧誘導因子-1α（HIF-1α）是維持低氧環境下的氧穩態的核心轉錄調控因子，HIF-1α介導一系列適應性反應，同時也可誘導肝細胞凋亡[5]。有研究表明在OSA[6]和COPD[7]肝組織中，HIF-1α表達水平上調，但在呼吸重疊綜合征中，肝組織HIF-1α的表達如何變化有待進一步研究。本研究通過模擬呼吸重疊綜合征模式下的IH合并肺氣腫大鼠模型，探討IH合并肺氣腫對大鼠肝臟HIF-1α、凋亡調控基因的影響，及HIF-1α與凋亡調控基因的相關性，以期為進一步探討通過藥理途徑抑制HIF-1α參與細胞凋亡奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性6周齡SPF級Wistar大鼠60只，體質量（180±20）g，許可證號：SCXK 津2010-0002。氣體氧濃度監測器（瑞士夏美頓公司產品），流量流速表（余姚工業自動化儀表廠），血氣分析儀（瑞士羅氏AVL 995），熏箱為玻璃箱改制，低氧艙為大號密封盒改制；梯度PCR儀(Bio-Rad公司)，熒光實時定量（qRT）PCR儀(Lightcycle Roche公司)，RNA濃度測定儀（環亞生物科技有限公司）。大前門烤煙型香煙（焦油含量23 mg/支，尼古丁含量約1 mg/支，天津卷煙廠生產）；Trizol購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自TIAN GEN生物技術公司，SYBR?Green購自Bio-Rad公司。低氧暴露裝置[8]按照編寫程序控制間歇低氧/正常氧循環次數及循環時間，按單片機芯片所預定程序，間接控制電磁閥通斷，繼而控制壓縮空氣或純氮通斷。自行設計密封盒低氧艙，兩端設有氣流進出開口，氣體流速儀器調定進入低氧艙中氣體流速大小，氧濃度測定儀測定艙內氧濃度變化。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 采用隨機數字表法將60只大鼠分為4組，每組15只。正常對照組：正常飼養；IH組：從第1周起在睡眠時段（9:00—17:00）將大鼠置于自制間歇低氧艙內，向艙內循環充入氮氣和空氣，每一循環120 s，即30 s充入氮氣（10 L/min），90 s充入空氣（15 L/min 50 s，5 L/min 40 s），1 h睡眠時間共進行30次循環[8]；肺氣腫組：從第1周起每天8:00和18:00（非睡眠時段）2次于自制熏箱內熏吸香煙共約1 h（每次約30 min）[9]；IH合并肺氣腫組：從第1周起熏煙暴露（方法同肺氣腫組）同時在睡眠時段（9:00—17:00）進行低氧氣體循環暴露（方法同IH組）。所有處理均持續14周。

1.2.2 血氣分析 于第9周初，每組隨機抽取5只大鼠固定后頭及胸部暴露于自制間歇低氧艙內，用利多卡因表面麻醉后開腹，暴露腹主動脈，于通入氮氣后40 s時及通入壓縮空氣50 s時，取4組的腹主動脈血檢測動脈血氣指標。測量結束后處死大鼠。

1.2.3 肺組織的留取 將剩余的每組10只大鼠麻醉后仰臥固定在操作臺上，開胸后暴露氣管并結扎右主支氣管，迅速取右肺下葉中段的少血組織放入10%福爾馬林固定液中固定2 h。石蠟包埋連續切片，常規HE染色后光鏡下觀察。取相同部位右肝組織（0.5 cm×0.5 cm），置于-80℃保存。

1.2.4 HIF-1α、Bax和Bcl-2 mRNA的表達測定 于肝組織中加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿3 min左右；加入200 μL氯仿室溫靜置3 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸取上層水相，加入同體積異丙醇，混勻，-80℃靜置25 min后，12 000 r/min，4℃離心10 min；棄上清，加入1 mL冰乙醇（75%無水乙醇，25%DEPC處理水，冰上配制），8 000 r/min，4℃離心5 min；棄上清，65 ℃烤箱烤5 min，加入 30 μL RNase-Free ddH2O，55 ℃烤箱助熔10 min；取2 μL測濃度及純度；取總RNA 3 μg進行逆轉錄，然后以qRT-PCR儀測定肝組織中HIF-1α mRNA 、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA。PCR總反應體系10 μL，循環參數：50℃ 2 min，95℃預變性3 min，然后95℃10 s，60℃30 s，72℃20 s，40個循環。PCR引物由華大基因合成，序列見表1。管家基因GAPDH標化樣品，結果數值以Ct值來表示，重復檢測3次取平均值。計算待測樣品△Ct=待測樣品目的基因Ct值－待測樣品GAPDH Ct值。待測樣品目的基因相對表達量為2-△Ct。

Table 1 Primer sequences of HIF-1α,Bax,Bcl-2 and GAPDH表1HIF-1α、Bax、Bcl-2及GAPDH引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件分析，定量指標采用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni法，相關性分析采用Pearson法，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

光鏡下肺氣腫組及IH合并肺氣腫組的肺組織切片HE染色均呈現明顯肺氣腫樣改變；血氣監測結果顯示單純IH組：血氧飽和度（SaO2）最低為0.864±0.018，動脈血氧分壓[p（O2）]為（50.00±2.74）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；肺氣腫合并IH組：SaO2最低為0.834±0.027，p（O2）為（47.80±3.56）mmHg，且上述2組的SaO2和p（O2）均周期性降低并恢復至正常水平。證實IH合并肺氣腫大鼠模型建立成功。

Figure 1 Comparison of expressions of HIF-1α mRNA(A),Bax mRNA(B),Bcl-2 mRNA(C)and Bax/Bcl-2(D)between four groups圖1 4組大鼠肝組織HIF-1α mRNA（A）、Bax mRNA（B）、Bcl-2 mRNA（C）及Bax/Bcl-2（D）比較

2.1 4組大鼠肝臟HIF-1α mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax/Bcl-2的表達水平比較 見圖1。與正常對照組相比，IH組的HIF-1α mRNA、Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平均上調，Bcl-2 mRNA水平下調（均Plt;0.05）；與正常對照組相比，肺氣腫組的HIF-1α mRNA水平上調，Bcl-2 mRNA水平下調（Plt;0.05），Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平無明顯變化（均Pgt;0.05）。與肺氣腫組和IH組相比，IH合并肺氣腫組的HIF-1α mRNA、Bax mRNA及Bax/Bcl-2水平均上調（均Plt;0.05）；與肺氣腫組相比，IH合并肺氣腫組的Bcl-2 mRNA水平下調（Plt;0.05）；與IH組相比，IH合并肺氣腫組的Bcl-2 mRNA水平無顯著變化（Pgt;0.05）。

2.2 肝組織HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Bax/Bcl-2的相關性分析 HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bax/Bcl-2水平呈正相關（r分別為0.732和0.699，均Plt;0.001），HIF-1α mRNA與Bcl-2 mRNA水平呈負相關（r=-0.705,Plt;0.001）。

3 討論

呼吸重疊綜合征為COPD和OSA并存的疾病[1]，IH和肺氣腫及由肺氣腫引起的持續低氧（SH）是呼吸重疊綜合征的主要病理學基礎[2-3]，故與單純的COPD和OSA相比，呼吸重疊綜合征患者的夜間氧飽和度明顯下降（IH并SH）[4]，其全身炎癥反應和氧化應激反應也有顯著的增加[1]。這些研究均表明呼吸重疊綜合征并不是OSA和COPD的簡單疊加，IH、肺氣腫及SH可協同致病。HIF-1α是維持低氧環境下的氧穩態的核心轉錄調控因子，常氧環境下濃度很低，低氧環境下與其他組織比較，肝組織HIF-1α表達明顯上調[6]。HIF-1α介導一系列適應性反應的同時也誘導了很多病理性反應，如細胞的凋亡[5]。本組研究顯示IH和肺氣腫處理均可導致HIF-1α mRNA水平上調。且IH合并肺氣腫處理后大鼠肝組織的HIF-1α mRNA水平較單純IH及肺氣腫處理顯著上調，說明IH和肺氣腫在誘導HIF-1α水平上調方面起協同作用，較單純的OSA、COPD而言，呼吸重疊綜合征對HIF-1α水平的影響更大。相比單純的OSA和COPD患者，呼吸重疊綜合征患者的嚴重低氧狀態以及低氧-再氧和產生的大量活性氧簇（ROS）直接協同導致了HIF-1α水平的上調，并且呼吸重疊綜合征患者嚴重的全身炎癥反應和氧化應激反應引起的細胞因子（如NF-κB）的增加也間接導致了HIF-1α水平上調。

HIF-1α參與并促進了肝細胞的凋亡[5]。OSA可通過觸發肝細胞凋亡而引起肝損傷[6]，Savransky等[10]對慢性IH引起的肝臟損害動物實驗研究中也發現肝細胞的凋亡，這些研究均表明肝細胞的凋亡在肝損傷中發揮著重要的作用。Bax、Bcl-2是調控細胞凋亡的管家基因[11]。本研究表明，IH暴露后Bax mRNA水平及Bax/Bcl-2較正常對照組均上調，Bcl-2 mRNA水平較正常對照組下調，提示IH對細胞凋亡調控基因產生了影響。同時本研究顯示肺氣腫組合并IH暴露后凋亡調控基因Bax mRNA水平及Bax/Bcl-2的比例較單純IH和肺氣腫暴露均上調，說明較單純的OSA和COPD，呼吸重疊綜合征狀態對細胞凋亡調控基因表達的影響更大，可引起更為嚴重的細胞凋亡，或可預示呼吸重疊綜合征狀態對肝組織的損害更大。

本研究結果顯示HIF-1α mRNA與Bax mRNA、Bax/Bcl-2水平呈正相關，與Bcl-2 mRNA水平呈負相關，提示 HIF-1α mRNA 與 Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達相關。Carmeliet等[12]研究中發現HIF-1α參與了細胞凋亡，并與Bcl-2的表達相關，與本研究結果相符。HIF-1α可通過識別序列5＇-(A/G)CGTG-3＇與靶基因的缺氧反應元件結合，進而調控靶基因的轉錄[13]。本研究結果提示HIF-1α可能通過調控靶基因Bax、Bcl-2的轉錄過程從而參與細胞凋亡，進而引起肝損傷。

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