雙聯(lián)抗血小板聚集藥物致小腸損傷的動物實(shí)驗(yàn)研究*

劉 霞 張志廣 李 熳 張雪蓮

隨經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）和植入藥物洗脫支架（DES）臨床應(yīng)用的增多，阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的雙聯(lián)抗血小板聚集治療已成為預(yù)防PCI患者支架內(nèi)血栓形成和減少缺血事件的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[1]。然而由于抗血小板聚集藥物的廣泛使用，其消化系統(tǒng)不良事件也日漸增多[2]。以往的研究較多關(guān)注于其對胃黏膜的損傷，而忽視了其對腸道損傷的影響。近年來隨著膠囊內(nèi)鏡和雙氣囊小腸鏡檢查的普及，越來越多的研究證實(shí)抗血小板聚集藥物所致小腸損傷也不在少數(shù)。已有研究發(fā)現(xiàn)非甾體類抗炎藥（NSAIDs）相關(guān)的小腸損傷在使用NSAIDs患者中發(fā)生并不罕見，損傷程度甚至超過了胃損傷[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究雙聯(lián)抗血小板聚集藥物對大鼠小腸的損傷，以期為臨床的預(yù)防及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠80只，6～7周齡，體質(zhì)量200～220 g（購自天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動物房）；拜阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；氫氯吡格雷片（天津騰麟發(fā)展有限公司）；依文思藍(lán)（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組20只。對照組給予生理鹽水灌胃；阿司匹林組（10.41 mg/kg）；氯吡格雷組（7.81 mg/kg）；阿司匹林10.41 mg/kg聯(lián)合氯吡格雷7.81 mg/kg組（雙抗組）。每天灌胃1次，連續(xù)14 d，以上所有大鼠每次灌胃液體量均按10 mL/kg計算，造模期間大鼠正常飲食飲水。

1.2.2 標(biāo)本制備 所有大鼠于末次灌胃后禁食不禁水18 h，予以3 mL/kg10%水合氯醛腹腔麻醉，分離出空腸和回腸，選取部分空腸段，嚴(yán)格無菌抽取空腸液于無菌EP管中，留作腸道菌群培養(yǎng)；在距離回盲部3 cm處取5 cm長度的小腸，予以兩端結(jié)扎后，腸腔注入0.3 mL 2%溴化乙錠（EB）予以保溫，60 min后處死大鼠，取出已結(jié)扎空腸段，留作小腸通透性檢測；小心分離腸系膜后，沿其對側(cè)剖開全部小腸，PBS沖洗干凈，觀察大鼠腹腔粘連情況；在距離回盲部40 cm處取近側(cè)端1 cm長度的空腸，PBS沖洗干凈，4%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，HE染色行組織學(xué)損傷評分。

1.2.3 小腸通透性檢測 采用Lange等[4]檢測小腸黏膜EB通透性的方法，即室溫條件下，以6 nmol/L乙酰半胱氨酸重復(fù)沖洗所取小腸段，直至沖洗液澄清，濾紙37℃干燥24 h后稱重，于3 mL甲酰胺中50℃孵育24 h，用紫外分光光度計測量612 nm波長處吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腸壁中EB含量。以腸壁中EB含量與腸壁質(zhì)量的比值代表小腸通透性。

1.2.4 空腸細(xì)菌培養(yǎng) 128倍稀釋空腸原液，取20 μL樣品接種于血瓊脂培養(yǎng)板中，置于CO2孵箱37℃孵育48 h后計數(shù)菌落，挑取菌落行革蘭染色和生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果以克隆集落單位/mL表示（注：由于經(jīng)費(fèi)及時間限制，本研究僅對雙抗組及對照組大鼠空腸液進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，如方差不齊則采用Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小腸黏膜大體表現(xiàn) 對照組大鼠小腸組織未見明顯損傷；阿司匹林組大鼠可見腸管粘連、水腫，黏膜可見充血、糜爛、潰瘍；而氯吡格雷組腸管粘連及水腫不明顯，黏膜可見少量散在點(diǎn)狀糜爛及小潰瘍；雙抗組大鼠腹腔內(nèi)可見腸管明顯粘連、水腫、擴(kuò)張，可見多處散發(fā)黏膜充血、糜爛及片狀潰瘍。

2.2 小腸黏膜病理觀察及損傷計分 對照組小腸絨毛排列整齊，偶見上皮缺損及少量炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯潰瘍及糜爛；阿司匹林組部分小腸絨毛結(jié)構(gòu)消失，可見壞死、糜爛及潰瘍形成，固有層可見炎細(xì)胞浸潤，部分上皮結(jié)構(gòu)完全破壞；氯吡格雷組大部分上皮結(jié)構(gòu)尚完整，但可見部分壞死及潰瘍形成；雙抗組大鼠大部分小腸絨毛結(jié)構(gòu)消失，固有層崩解，可見壞死、糜爛及潰瘍形成，黏膜下層結(jié)構(gòu)混亂，固有層可見大量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)充血水腫，部分上皮結(jié)構(gòu)完全破壞，見圖1。光鏡下每樣本隨機(jī)計數(shù)20個視野，每個視野按Chiu標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行損傷評分[5]，最后病理評分為20個視野的平均數(shù)。各實(shí)驗(yàn)組大鼠小腸黏膜的病理損傷評分均高于對照組，見表1。

Table 1 Comparison of the pathological scores and EB content of small intestinal mucosa between four groups表1 各組大鼠小腸黏膜病理損傷評分及小腸壁EB含量比較

2.3 小腸通透性檢測 與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組大鼠小腸通透性均明顯增高，阿司匹林組EB濃度高于氯吡格雷組，雙抗組高于阿司匹林組及氯吡格雷組（均P＜0.05），見表1。

2.4 空腸細(xì)菌培養(yǎng) 雙抗組大鼠空腸液細(xì)菌總量較對照組明顯增多，腸桿菌與腸球菌比例較對照組明顯下降（P＜0.01）見表2。

Table 2 The total bacteria and the ratio of enterobacterium and enterococcus in two groups表2 各組大鼠空腸細(xì)菌總量及空腸桿球菌比例

3 討論

阿司匹林是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的抗血小板聚集藥物，它所致的黏膜損傷機(jī)制可能包括對黏膜直接損傷的局部作用及依賴環(huán)氧合酶途徑的全身作用。氯吡格雷是一種血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受體拮抗劑，屬于噻吩吡啶類衍生物，是不具有抗血小板聚集活性的前體藥物，其活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板聚集作用，并可抑制促血管生長因子合成，從而導(dǎo)致新生血管形成障礙，使得受損傷黏膜修復(fù)受阻[6]。目前尚無確切證據(jù)表明氯吡格雷具有獨(dú)立的胃腸道黏膜損傷作用。但從本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單用氯吡格雷可促使小腸黏膜出現(xiàn)潰瘍。

膠囊內(nèi)鏡和雙氣囊小腸鏡的廣泛應(yīng)用促使抗血小板聚集藥物的小腸損傷日益受到重視。Lanas等[7]認(rèn)為NSAIDs所致的遠(yuǎn)端消化道損傷同樣常見，甚至更加普遍，其所致的腸道損傷包括黏膜通透性增加、黏膜炎癥、吸收功能障礙、蛋白丟失、回腸功能障礙、腹瀉、黏膜潰瘍以及腸腔狹窄等。Fortun等[8]則認(rèn)為在長期服用NSAIDs的患者中，至少有2/3的患者會出現(xiàn)亞臨床腸病，但并不認(rèn)為COX依賴性機(jī)制在其中起著重要的作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)外源性PGs并不能阻斷NSAIDs誘導(dǎo)的小腸損傷，因此NSAIDs誘導(dǎo)的小腸損傷并不是單純通過抑制PGs合成來實(shí)現(xiàn)的[9]。

“三級打擊”學(xué)說是目前NSAIDs相關(guān)性小腸黏膜損傷發(fā)病的機(jī)制，包括：（1）藥物酸性部分直接損傷膜磷脂，通過使氧化磷酸化解偶聯(lián)而進(jìn)一步損傷線粒體，甲硝唑可阻斷該作用，其可能機(jī)制為降低線粒體氧耗。（2）線粒體損傷后致細(xì)胞能量耗竭、Ca2+超載及大量自由基產(chǎn)生，最終使細(xì)胞間完整性破壞，并導(dǎo)致小腸通透性增加。（3）黏膜屏障受損使腸黏膜細(xì)胞易受包括膽汁、食物、細(xì)菌及各種酶在內(nèi)的腸內(nèi)容物損傷。本實(shí)驗(yàn)以該學(xué)說為基礎(chǔ)，從小腸通透性，腸道菌群等方面進(jìn)行探討。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組腸黏膜中EB含量較對照組增高，表明阿司匹林、氯吡格雷均能顯著增加小腸黏膜通透性，并且阿司匹林組較氯吡格雷組大鼠小腸通透性增高更為明顯，雙抗組大鼠小腸通透性最高，同時與大體及病理損傷相一致，提示腸道損傷導(dǎo)致了小腸通透性的增高。

細(xì)菌移位（BT）出現(xiàn)在小腸黏膜通透性升高的基礎(chǔ)上，移位的細(xì)菌及內(nèi)毒素通過趨化中性粒細(xì)胞，釋放大量炎癥因子和氧自由基而進(jìn)一步加重黏膜損傷，造成惡性循環(huán)。但目前國內(nèi)外對NSAIDs相關(guān)小腸損傷發(fā)生BT的研究缺乏文獻(xiàn)支持，僅Iwai等[10]報道了予以NSAIDs的大鼠小腸黏膜中，腸道細(xì)菌數(shù)量增加。另有報道大鼠應(yīng)用NSAIDs后，小腸細(xì)菌數(shù)量顯著增加，而給予抗生素能減輕腸病的嚴(yán)重程度，此外在無菌大鼠中誘發(fā)的小腸損傷明顯減輕[11]，據(jù)此提出腸道細(xì)菌在NSAIDs腸病中的作用。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，抗生素可逆轉(zhuǎn)NSAIDs所致的上皮細(xì)胞通透性增高。Reuter等[12]報道，腸腔內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增加是發(fā)生在腸道通透性增高之后，且只發(fā)生在應(yīng)用了具有顯著肝腸循環(huán)的NSAIDs之后。因此，腸腔細(xì)菌數(shù)量增加可能只是NSAIDs導(dǎo)致腸通透性增高的結(jié)果，從而加劇損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了與上述文獻(xiàn)報道相一致的結(jié)果，即雙抗組大鼠小腸細(xì)菌數(shù)量較正常對照組明顯升高，并與小腸通透性增高相一致，且腸桿菌與腸球菌比例較對照組明顯下降，提示腸道損傷可能導(dǎo)致了細(xì)菌數(shù)量增多及菌群失調(diào)。

Figure1 The histopathological images of small intestinal mucosa in four groups圖1 各組大鼠小腸黏膜組織學(xué)表現(xiàn)（HE染色，×100）

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