解脲脲原體血清1型與8型對小鼠生殖道的致病性研究

鄭冰潔 尹躍平 韓燕 施美琴 向志 于瑞星

·論著·

解脲脲原體血清1型與8型對小鼠生殖道的致病性研究

鄭冰潔 尹躍平 韓燕 施美琴 向志 于瑞星

目的探討相同條件下,解脲脲原體血清1型(Up1)和8型(Uu8)在BALB/c小鼠生殖道感染模型中的致病性。方法48只BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、雌激素組、Up1感染組、Uu8感染組,每組12只。分別接種無菌液體培養基、Up1、Uu8標準菌液。接種后第3、7、14、21天,每組隨機取3只小鼠,采集陰道灌洗液后處死,取陰道、子宮標本固定后,HE染色鏡檢。陰道灌洗液用于培養和腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測。結果接種后空白組和雌激素組均無解脲脲原體生長,TNF-α為(4.17±0.85)pg/ml。 兩個感染組各時間點小鼠陰道沖洗液經培養均為陽性,隨著時間延長,測定顏色改變單位逐漸下降。TNF-α在感染后第14天達峰值,分別為(14.93±1.11)pg/ml和(27.04±24.26)pg/ml。組織病理結果顯示,Up1和Uu8感染后均可導致急慢性炎癥反應,以子宮病變為主,Up1可導致宮腔粘連。結論BALB/c小鼠下生殖道感染Up1和Uu8后,主要導致宮頸炎,兩組致病性未見明顯差異。Up1可能與宮腔粘連有關。

解脲支原體;小鼠,近交BALB/c;毒力

已發現解脲脲原體具有14種血清型、分屬于微小脲原體(Ureaplasma parvum,Up)及解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum,Uu)兩種生物群[1],且14種血清型之間致病性不同。為研究不同血清型之間致病性,我們選擇微小脲原體血清型1型(Up1)和解脲脲原體血清型8型(Uu8)兩種血清型,在BALB/c小鼠下生殖道接種相同濃度的兩種菌液,并觀察其致病性的差異情況。

資料與方法

一、資料

6周齡雌性SPF級BALB/c小鼠購自揚州大學動物中心[SCXK(蘇)2012-0004],于中國醫學科學院皮膚病研究所實驗動物中心按要求喂養。體重(19.5±1.86)g。Up1和Uu8的標準菌株為美國標準生物品收藏中心產品。苯甲酸雌二醇注射液為天津金耀氨基酸有限公司產品。Uu液體及固體培養基為實驗室自制。小鼠腫瘤壞死因子(TNF)αELISA試劑盒為南京凱基生物科技發展有限公司產品。

二、方法

菌液制備：Up1和Uu8標準菌株凍干粉經傳代培養后,測定顏色改變單位(color change unit,CCU)并配制成1×107ccu/ml濃度的菌液,-20℃凍存備用。

動物模型的建立：48只雌性BALB/c小鼠稱重后分為空白組、雌激素組、Up1感染組、Uu8感染組。實驗前使用液體及固體培養基對每只小鼠的陰道沖洗液進行Uu檢測,確證每只小鼠實驗前不攜帶Uu。各組小鼠在標準條件下適應環境喂養1周后,除空白組外,其余3組小鼠隔日單側大腿外側肌內注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 ml(1 ml/mg),直至實驗結束。空白組則不作任何處理。在第4次注射雌二醇當天,除空白組外,其余各組小鼠腹膜外注射10%烏拉坦0.1 ml麻醉后接種。雌激素組：使用移液器吸取20 μl無菌Uu液體培養基接種于小鼠陰道內,接種后將小鼠仰臥靜止1 min;感染組：使用移液器吸取20 μl將濃度為1×107ccu/ml的Up1和Uu8標準菌液分別接種于相應各組小鼠的陰道內(深入陰道0.5 cm),接種后仰臥靜止1 min。接種后第2天,重復接種1次以加強感染。

小鼠大體情況觀察：接種后每日觀察小鼠活動情況、外生殖道表現及外陰分泌物情況等并拍照記錄。

Uu檢測：接種后第3天、第7天、第14天、第21天分別取各組3只小鼠,用移液器吸取生理氯化鈉液50 μl深入小鼠陰道0.5 m處,停留30 s后回收沖洗液,反復3次,所得到150 μl陰道沖洗液分裝,一部分用于檢測TNF-α,另一部分同時接種于液體及固體培養基中,并做ccu計數。37℃、5%CO2和90%～95%N2環境中培養。48～72 h觀察結果：以液體培養基由黃色變為紅色且保持澄清,固體培養基中出現棕黑色海膽樣菌落為陽性。

TNF-α測定：取100 μl陰道灌洗液10 000×g離心5 min,收集上清液后按試劑盒說明書流程檢測。

組織形態學觀察：采集陰道沖洗液,將小鼠頸椎脫臼處死,肉眼觀察并記錄其生殖器外觀,解剖取其陰道、子宮標本,4%甲醛液固定后,常規石蠟包埋切片,HE染色鏡檢。

三、統計學分析

使用SPSS 13.0統計軟件包檢驗。計量資料使用t檢驗,計數資料使用Fisher精確檢驗,檢驗水平α=0.05。

結 果

一、Uu培養結果

在各時間點采集的陰道沖洗液標本中,空白組和雌激素組培養后均為陰性。接種后第3、7、14天,兩感染組3只小鼠培養均為陽性。接種后第3天,Up1組ccu值為1×(106～109)ccu/ml,Uu8組為1×(107～109)ccu/ml。隨著感染時間延長,液體培養ccu值均下降,接種后第7天ccu范圍兩組分別為1 ×(105～ 109)ccu/ml和 1 ×(105～ 108)ccu/ml。至接種后第21天實驗結束時,兩組中均僅有1只為陽性,ccu值均為1×105ccu/ml。

二、TNF-α檢測結果

接種后各時間點空白組和雌激素組中各小鼠陰道沖洗液中TNF-α值較為接近,為(4.17±0.85)pg/ml。接種后第3天,Up1和Uu8兩組小鼠陰道沖洗液中TNF-α值接近空白組,分別為(5.92±2.66)pg/ml和(5.85±1.74)pg/ml。接種后第7天,兩組TNF-α均略有下降,分別為(4.24±1.51)pg/ml和(3.29±1.34)pg/ml,差異無統計學意義。接種后第14天,兩組TNF-α水平上升明顯,分別為(14.93±1.11)pg/ml和(27.04± 24.26)pg/ml。接種后第21天,兩組TNF-α水平較前均有下降,分別為(11.67±4.51)pg/ml和(15.01± 14.30)pg/ml。 各組、各時間點之間,差異均無統計學意義(Studentt檢驗),見表1。

三、器官大體形態及組織病理表現

大體形態：空白對照組及雌激素組小鼠各時間點子宮、陰道外觀均無異常;感染組小鼠各時間點有不同程度子宮水腫、充血、陰道充血、分泌物增多等。組織病理表現：各組陰道標本除感染組黏膜層及結締組織層有較多嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤外,空白組及雌激素組僅見少量炎癥細胞浸潤。子宮標本中,空白組未見明顯異常。雌激素組子宮內膜及固有層內可見少量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤,伴有腺體擴張、分泌物增多(圖1)。Up1組和Uu8組小鼠每個時間點均可見子宮內膜及固有層較多炎細胞浸潤,腺體擴張、分泌物潴留、固有層水腫、宮腔內有較多炎性滲出物。同時,Up1組小鼠在感染后21 d可見有不同程度的宮腔粘連,而Uu8組未發現此種改變(圖2,3)。

表1 各組小鼠接種后腫瘤壞死因子α濃度(±s) pg/ml

表1 各組小鼠接種后腫瘤壞死因子α濃度(±s) pg/ml

組別 第3天 第7天 第14天 第21天Up1 5.92±2.66 4.24±1.51 14.93±1.11 11.67±4.51 Uu8 5.85±1.74 3.29±1.34 27.04±24.26 15.01±14.30雌激素組 4.42±0.39 4.35±0.35 3.6±1.04 3.73±1.61空白組 4.54±0.94 4.68±0.61 3.9±0.78 4.10±0.94

圖1 雌激素組小鼠子宮內膜及固有層內少量炎細胞,伴有輕度腺體擴張及分泌物潴留(箭頭,HE×100)

圖2 Up1感染組小鼠子宮內膜及固有層內大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤,伴有腺體擴張,分泌物潴留(綠箭頭)。宮腔內可見較多炎性滲出物,及宮腔粘連(箭頭,HE×200)

圖3 Uu8感染組小鼠子宮內膜及固有層大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤,腺體擴張及分泌物潴留較明顯,未見宮腔粘連(箭頭,HE×

討 論

Uu是泌尿生殖道最常見機會致病微生物之一,其致病性及致病機制尚不明確,可引起包括非淋球菌性尿道炎(NGU)在內的多種泌尿生殖道疾病[2-3],如前列腺炎、附睪炎、陰道炎、宮頸炎等。此外,Uu感染女性后,還可導致不孕癥、不良妊娠和新生兒分娩時產道感染等。根據其分子生物學特性的不同,可將其分為2個生物群14個血清型,生物群1(Parvo)即 Up 包括血清學 1、3、6、14 型,均含有17 000 多肽;生物群 2(T960)即 Uu 包括 2、4、5、7、8、9、10、11、12、13 型等 10 個血清型,均含有 16 000和17 000多肽。14種血清型之間的致病性差異尚未明確。

我們利用生物群1和生物群2中兩株檢出率較高、致病性較強的1型和8型建立動物模型,觀察到接種后,兩組小鼠陰道灌洗液中雖可通過液體培養和固體培養確證的方法檢出有Uu存在,但從組織病理結果看,Uu對陰道上皮并未造成過多影響,而在感染后的3～21 d內,對子宮造成了明顯的急慢性炎癥反應。首先表現為宮腔內炎性滲出、分泌物潴留、子宮內膜及固有層大量中性粒細胞浸潤的急性炎癥反應。隨著接種后時間的延長,兩組子宮內膜及固有層內均出現大量漿細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞,伴有腺體擴張、腺腔失去完整性。感染后第21天,Up1組小鼠子宮標本中出現了宮腔粘連,但Uu8組未出現此種表現。表明Up1感染后,在陰道上皮可能僅是定植但不造成病理改變,而主要造成子宮內膜炎、宮頸炎等,且可能與宮腔粘連有關。目前多項研究表明[4-7],生物群1主要與定植或正常攜帶有關,而生物群2可能與尿道炎、陰道炎、黏液膿性宮頸炎等有關。也有研究表明,1型、4型和8型在性亂人群、黏膿性宮頸炎患者及胎膜早破產婦中檢出率均較高。但我們接種的菌液濃度為1×107ccu/ml,較其他實驗的菌液濃度高1～2個數量級,并且進行了重復接種。子宮粘連是否與接種菌量較大且重復接種有關仍需深入地研究。此外,實驗過程中,為了使小鼠對Uu易感,雌激素肌內注射貫穿始終,這些均有可能導致結論的差異。樣本量較少也會產生一定的影響。

TNF-α作為一種重要的炎癥細胞因子,參與了炎癥反應的多個環節。Salvatore等[8]在BALB/c小鼠呼吸道肺炎支原體感染模型中發現,接受甘氨酰環素治療的小鼠呼吸道灌洗液中TNF-α水平明顯低于接受安慰劑治療的小鼠。考慮到TNF-α作為重要的炎癥細胞因子之一,可能在一定程度上反映了炎癥反應的嚴重程度。故此次實驗我們用TNF-α作為Uu感染后導致的炎癥反應的間接指標。試驗中,觀察到接種后隨著時間的延長,兩感染組的TNF-α水平均出現了先降低后升高的過程。在接種后的第3～7天,TNF-α均有所降低,但基本相同。表明早期小鼠陰道上皮對Uu感染后導致的急性炎癥反應并未發揮免疫保護作用。而感染后的第14天,TNF-α達到峰值,結合病理表現,表明機體免疫系統對Uu的免疫反應逐漸增強,發揮了保護作用。而后TNF-α水平又有所降低,而此階段病理表現則反映為慢性炎性反應,結合此階段ccu結果,表明Uu感染后可導致長期定植及慢性炎性反應,進而導致宮腔粘連及不孕等。

志謝 本所真菌科沈永年、病理科桑紅桂,邵雪寶老師以及東南大學附屬中大醫院病理科張愛鳳老師

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2013-05-29)

(本文編輯：吳曉初)

Pathogenicity ofUreaplasma urealyticumserotype 1 and 8 in the genital tract of female BALB/c mice

Zheng Bingjie，Yin Yueping，Han Yan，Shi Meiqin，Xiang Zhi，Yu Ruixing.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Collage;Reference Laboratory，National Center for Sexually Transmitted Disease Control，China Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210042，China

Yin Yueping，Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo compare the pathogenicity betweenUreaplasma urealyticumserotype 1(Up1)and 8(Uu8)in the genital tract of BALB/c mice.MethodsA total of 48 BALB/c mice were randomly and equally divided into four groups:blank control group receiving no treatment，estradiol group pretreated with intramuscular injection of estradiol followed by intravaginal inoculation with sterial liquid culture media，Up1 and Uu8 groups pretreated with intramuscular injection of estradiol followed by intravaginal inoculation with suspensions of Up1 and Uu8 respectively.Three mice were randomly selected from each group to be sacrificed after the collection of vaginal lavage fluid on day 3，7，14 and 21 after the inoculation.Vaginal and uterine tissue specimens were obtained from these sacrificed mice and underwent hematoxylin and eosin(HE)staining.Vaginal lavage fluid samples were subjected to culture of Uu and measurement of tumor necrosis factor-α (TNF-α).ResultsNo evidences were observed for Uu growth in either the blank control group or estradiol group at any of the time points after the inoculation，with the average level of TNF-α in vaginal lavage fluid being(4.17 ± 0.85)pg/ml at these time points in both groups.Uu grew in all the vaginal lavage fluid samples from the Up1 and Uu8 groups at the four time points，with the color change unit(CCU)value decreasing with time.The level of TNF-α in vaginal lavage fluid peaked on day 14 after the inoculation in the Up1((14.93±1.11)pg/ml)and Uu8((27.04±24.26)pg/ml)groups.Both Up1 and Uu8 infection caused acute and chronic inflammatory responses in the mice，which were mainly located in the uterus，and Up1 might cause intrauterine adhesion.ConclusionsAt the same inoculation concentration，no significant difference is found in the pathogenicity between Up1 and Uu8，both of which appear to mainly cause cervicitis.Up1 might be partially responsible for intrauterine adhesion in mice.

Ureaplasma urealyticum;Mice,inbred BALB/c;Virulence

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.005

國家十二五“重大新藥創制”科技重大項目(2012ZX09301002005)

210042南京,中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所、中國疾病預防控制中心性病中心參比實驗室

尹躍平,Email：yinyp@ncstdlc.org