連豆清脈方水提液干預(yù)ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡及Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表達的實驗研究

周春剛，張志斌，陸 曙

(無錫中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)藥研究所，江蘇無錫214061)

動脈粥樣硬化(AS)中醫(yī)病因病機復(fù)雜，但以肝、脾、腎虧虛為本，以火毒與血瘀、痰濕等濁邪為標，“熱”“濁”“腎虛”是AS的基本病理因素，“清熱”“泄?jié)帷薄把a腎”成為治療動脈粥樣硬化的主要治則［1］。筆者在臨床根據(jù)此治則處方用藥取得良好效果［2-3］，經(jīng)過多年積累，常以自擬“連豆清脈方”為基礎(chǔ)方加減，藥用:連翹、野料豆、赤芍、萊菔子、牡丹皮等。動脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮細胞凋亡、血管內(nèi)皮功能紊亂，可能影響血壓調(diào)節(jié)，導(dǎo)致平滑肌增生、移位、血液凝固，是血管損傷的重要機制。很多致動脈硬化因子包括氧化低密度脂蛋白、ANGⅡ、氧化應(yīng)激均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡［4］，而中醫(yī)藥治療動脈粥樣硬化，對防治血管內(nèi)皮功能紊亂的作用及機制研究已經(jīng)取得一定的進展［5］。為探討連豆清脈方防治動脈粥樣硬化作用機制，筆者通過建立ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡模型，探討連豆清脈方對內(nèi)皮細胞線粒體損傷途徑的保護作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 大鼠動脈內(nèi)皮細胞細胞株(RAOEC R304-05)，從上海拜力生物科技有限公司購買。

1.2 藥物和試劑 DMEM高糖(GIBCO)，10%FBS(GIBCO)，0.25% 胰酶(GIBCO)，Angiotensin Ⅱ5mg(美國ENZO)，Annexin V/PI雙染流式細胞凋亡檢測試劑盒(美國 BD)，SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ試劑盒(TAKARA DRR083S)，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(KGA-601-604)。

1.3 主要儀器 流式細胞儀(美國BD)，LightCycler480 PCR儀(德國ROCHE)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NUAIRE)。

2 實驗方法

2.1 連豆清脈方水提液制備 連豆清脈方組成:野料豆 15 g，連翹 10 g，黃連 3 g，知母 10 g，赤芍 10 g，牡丹皮10 g，萊菔子10 g。水提液制備采用水提醇沉法，采用 DMEM高糖培養(yǎng)基定容，再以孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝，使其含生藥量為50 mg/mL(原液)，－70℃貯存?zhèn)溆谩！?br>